2.3.1.1. Nghiên cứu về tắnh trạng mùi thơm
a. Bản chất hóa học của mùi thơm
Trên thế giới, tắnh trạng mùi thơm ựã ựược nghiên cứu khoảng từ thập kỷ 80 của thế kỷ XX. Mùi thơm hay còn gọi là bột thơm, khi nấu cơm mùi vị bốc hơi cho thấy một hợp chất chắnh của formaldehydes, ammonia, hydrogen sulfide. Theo (Lorrieux và cs, 1996) cho biết mùi thơm ựược tạo nên bởi hơn một trăm loại chất dễ bay hơi như hydrocarbon, aldehydes, ketons, acids, esters, phenols, pyridines, pyrazines, 2-acetyl-1- pyrroline và thành phần khác khi nấu cơm. đã có rất nhiều phương pháp giúp có thể xác ựịnh ựược mùi thơm của lúa bao gồm cả ựịnh tắnh và ựịnh lượng.
Các phương pháp ựịnh tắnh như nếm hạt giúp người nếm cảm nhận ựược mùi thơm của hạt gạo khi nhai, phương pháp ngửi mùi mẫu lá hoặc hạt gạo ngâm trong dung dịch KOH 1,7% hoặc I2-KI theo (Sood và cs, 1978). Các phương pháp ựịnh lượng ựược xây dựng dựa trên việc xác ựịnh thành phần chắnh của mùi thơm.
Theo (Buttery và cs, 1983) thì 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) là chất bay hơi và là thành phần chắnh tạo nên mùi thơm ở lúa. Các phương pháp giúp xác ựịnh hàm lượng 2AP gồm có: gas chromatography-flame ionization Detector( GC-FID) (Butterry và cs, 1986), (Hien và cs, 2006) ựã xác ựịnh hàm lượng 2AP trong các giống lúa thơm cho thấy trong giống Jasmine 85 có 212ppb, Khao Dawk Mali 105 có 332,2ppb, Nàng Thơm Chợ đào2 có 83,6ppb.
Cấu tạo 2-acetyl-1-pyrroline:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 29
ựược tạo thành trong ựiều kiện nhiệt ựộ bình thường và ựược tạo ra ở tất cả các bộ phận phắa trên mặt ựất. L-proline là acid amin khởi ựầu cho sự tổng hợp ra 2AP vì khi bổ sung acid amin này vào ựất trong giai ựoạn cây con thấy hàm lượng 2AP tăng gấp 3 lần ựối chứng. Ngoài ra cũng (Yoshihashi và cs, 2004) thì 2AP ựược dự trữ trong phần kị nước của các hạt tinh bột.
b. Di truyền của tắnh trạng mùi thơm và ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu mùi thơm của gạo
Nghiên cứu di truyền ựầu tiên, ựược thực hiện bởi nhóm của Tankskey (Ahn và cs, 1992), ựã ựưa ra kết luận rằng vùng gen kiểm soát mùi thơm hoặc gen frg
nằm trên cánh tay dài của NST số 8. Sau ựó, Lorieux và cs (1996) ựánh dấu gen này như một gen chắnh và là gen lặn ựể ựánh giá locus tắnh trạng số lượng (QTL) trong cùng một vùng, nhưng giới hạn trong khoảng 12cm không gian di truyền, trong (IR64xAzucena) quần thể ựơn bội kép nơi có nhiều vùng của giống Azucena truyền thống tạo nên mùi thơm. Lần ựầu tiên, nghiên cứu này ựã chứng minh rằng 2-ACP phát hiện bằng các phương pháp nhạy và phương pháp gas chromatography (GC) có tương quan hoàn hảo và sự biến ựổi về số lượng lớn ựã ựược quan sát trong ựường quần thể ựơn bội kép thơm. Hơn nữa, trong nghiên cứu này, hai QTL nhỏ khác ựược xác ựịnh trên NST 4 và NST 12, ựiều này có thể ảnh hưởng ựến mùi thơm. Kể từ ựó, một số báo cáo của các tác giả chủ yếu là xác ựịnh chỉ thị phân tử (ựánh dấu SSR, PCR) liên kết với locus frg có thể ựược sử dụng phân biệt thơm và không thơm ựể lựa chọn chỉ thị phù hợp nhất (Garland và cs, 2000; Cordeiro và cs, 2002; Jin và cs, 2003).
Ahn và cs (1992) ựưa ra một chỉ thị phân tử kắ hiệu là RG28 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 liên kết gần với gen thơm (frg). Chỉ thị phân tử này có thể áp dụng ựể dự ựoán sớm sự có mặt của gen quy ựịnh mùi thơm trên một giống lúa, ựồng thời có thể phân biệt ựược tắnh trạng ựồng hợp tử hay dị hợp tử của gen thơm và chỉ thị này rất hữu dụng trong việc phát hiện nhanh mùi thơm trong các dòng lai (Ahn và cs, 1993).
Gần ựây hơn, (Bradbury và cs, 2005) ựã công bố một nghiên cứu về vị trắ, cấu trúc và cơ chế của gen frg quy ựịnh tắnh trạng mùi thơm của lúa. Trong nghiên cứu này, Bradburry và cộng sự ựã phát hiện 8 ựột biến mất ựoạn và 3 SNPs trên exon của gene mã hóa tổng hợp betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BAD2) chắnh là nguyên nhân
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30
hình thành tắnh thơm trên các giống luá thơm Basmati (Bradbury và cs, 2005). Các giống lúa không thơm sẽ có bản gen mã hóa BAD2 ựầy ựủ, trong khi các giống lúa thơm sẽ có bản gen mã hóa BAD2 chứa ựột biến mất ựoạn và các SNPs. Hậu quả của sự thay ựổi cấu trúc này sinh ra một mã dừng làm mất tác dụng của enzyme BAD2. Ngoài ra, các tác giả ựã sử dụng các Bacterial Artificial Chromosome (nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn) ựể kiểm tra vị trắ của gen frg và ựã phát hiện ựược vị trắ chắnh xác của gen này trên NST 8.
Từ ựó, (Bradbury và cs, 2005) ựã thiết kế một bộ mồi bao gồm 4 mồi: ESP, EAP, IFAP, INSP giúp phân biệt kiểu gen của các giống lúa ựồng hợp tử thơm (cho băng 257 bp), dị hợp tử thơm (cho 2 băng dài 355 bp và 257 bp) và không thơm (cho băng dài 355 bp). Tuy nhiên, bộ mồi này chỉ sử dụng ựược cho lúa tẻ mà không sử dụng ựược cho lúa nếp.
Theo (Phan Hữu Tôn và Tống Văn Hải, 2010) khi tiến hành sàng lọc xác ựịnh gen mùi thơm trên các giống lúa thu ựược kết quả hầu hết các giống lúa nếp (chủ yếu thuộc loài phụ japonica) có mùi thơm lại không mang gen frg. điều này cũng chứng tỏ bản chất di truyền tắnh trạng mùi thơm ở lúa nếp khác với lúa tẻ. Các nghiên cứu về tắnh trạng mùi thơm ở các giống lúa nếp vẫn còn rất hạn chế.
Nghiên cứu của (Bourgis và cs, 2008) về gen mùi thơm ở giống lúa thơm thuộc loài phụ japonica ở lúa trồng châu Á ựã cho thấy sự biểu hiện mùi thơm ở các giống lúa thơm japonica không phải do gen frg quy ựịnh mà tuân theo một cơ chế phân tử khác. điều này ựã mở ra một hướng mới ựể xác ựịnh sự có mặt của gen thơm trong lúa nếp do hơn 75% các giống lúa nếp thuộc loài phụ japonica.
Trong nghiên cứu, (Bourgis và cs, 2008) sử dụng quần thể lai giữa Azucena và IR64, một giống indica không thơm và trình tự bộ gen của Nipponbare (japonica) và 93-11 (indica) cũng như một thư viện Azucena BAC, ựể xác ựịnh gen
frg chắnh trong Azucena. Nghiên cứu ựã xác ựịnh ựược một gen mã hóa tổng hợp betaine aldehyde dehydrogenase 2 khác (gen badh2) là một locus ứng viên chịu trách nhiệm về mùi thơm, có sự biểu hiện ựột biến giống như ở giống lúa thơm Basmati và Jasmine. So sánh, phân tắch gen cho thấy sự bảo tồn trình tự rất cao giữa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 31
của alen BADH2 trong 93-11. Các badh2 ựột biến và MITE ựã ựược khảo sát trong các giống lúa thơm truyền thống và không thơm. Giống có mùi thơm sẽ vắng mặt một MITE và có mặt allen badh2 (ựột biến 12 bp tại exon7 của allen badh2).
Do phát hiện thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các ựột biến 12 bp ựã quan sát trong các giống thơm truyền thống nên Bourgis ựã dự ựoán có sự liên quan giữa cắt ngắn protein, tổng hợp 2-ACP và sự biểu hiện mùi thơm gạo. Sự vắng mặt của MITE liên quan ựến ựột biến biểu hiện mùi thơm. Giả thuyết ựược ông ựưa ra là alen BADH2 có chức năng không cắt ngắn, enzyme betaine aldehyde hoặc cơ chất của nó bị oxi hóa dẫn, 2-ACP bị tiêu thụ và không ựược tắch lũy. Ngược lại, khi xảy ra ựột biến, alen badh2 không có chức năng như trên, biểu hiện mùi thơm có thể ựược giải thắch bằng việc sửa ựổi hoặc làm gián ựoạn con ựường tổng hợp tự nhiên dẫn ựến tắch lũy 2-ACP hoặc tiền chất. Hoặc một giả thuyết khác về vai trò ựiều tiết gen của alen badh2 cũng không thể dứt khoát loại trừ (Bourgis và cs, 2008).
Sự biểu hiện mùi thơm khi có mặt alen badh2 có thể phần lớn phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và nền tảng di truyền thuận lợi cho biểu hiện của gen hoặc sự quan tâm ựặc biệt của người dân ựịa phương, như là trường hợp của lúa Basmati (Tang và cs, 2007). Lúa Basmati trồng ở chân ựồi Nepal, trong thời ựiểm ra hoa ở nhiệt ựộ lạnh sẽ tăng biểu hiện mùi thơm của giống. Hay các giống indica KDM105 thể hiện mùi thơm cao hơn khi nó ựược trồng ở những vùng thường bị hạn hán (Yoshihashi và cs, 2002).
để xác ựịnh giống thơm/không thơm, Bourgis và cs (2008) ựã sử dụng cặp mồi: AR_5: 5′ - TTG TTT GGA GCT TGC TGA TG-3′ và AR_3: 5′ACC AGA GCA GCT GAA ATA T-3′ ), AR_5 và AR_3: 5Ỗ-GGA GCA GCT GAA GCC ATA ATC-3Ỗ, và một mồi khác xác ựịnh sự hiện diện của MITE là MITE_5 5Ỗ- GCA GAC AAA CTT AAA AAC CGA CT-3Ỗ và MITE_3 5Ỗ- TCA GAA ATT TTA TCA TTT TTG TTA CG-3Ỗ.
Gần ựây, một badh2 mới không alen ựược ựặc trưng bởi một ựoạn xóa khác trong exon2 ựã ựược chứng minh trong các giống japonica ở Trung Quốc (Shi và cs, 2008). Mô tả ựặc ựiểm vùng gen mùi thơm trong những giống này thể hiện các ựột biến badh2, nhưng lại không cần thiết biểu hiện mùi thơm, nó có thể cần thiết cho việc xác ựịnh các gen khác cũng có thể tham gia vào qua trình tổng hợp và biểu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 32
hiện mùi thơm. điều này góp phần lựa chọn một nền tảng di truyền tốt hơn ựể thúc ựẩy biểu hiện mùi thơm ở giống lúa.
2.3.1.2. Chiều dài, rộng và tỷ lệ dài/rộng của hạt
Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt gạo là những ựặc tắnh quan trọng nhất ựối với các giống lúa chất lượng. Gạo ựược phân loại theo mục ựắch thương mại thành dạng hạt ngắn, hạt vừa, hạt dài và hạt thon. Tuy nhiên, trên thị trường dạng gạo thon dài là ựược ưa chuộng nhất.
Hình dạng hạt gạo là ựặc tắnh của giống tương ựối ổn ựịnh, ắt bị thay ựổi do ựiều kiện ngoại cảnh. Tuy nhiên, nếu sau khi nở hoa, nhiệt ựộ hạ xuống có thể là giảm chiều dài nhưng không nhiều. Nếu những cá thể có hình dạng dạng ựẹp ở F2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thì ắt biến ựổi ở các thế hệ sau. Vì vậy, trong các quần thể từ F3 hay các dòng thuần không có hy vọng chọn lọc ựược dạng hạt ựẹp hơn F2 hoặc nguyên bản (Nguyễn Thị Trâm, 1998).
Chiều dài và hình dạng hạt di truyền ựộc lập nên có thể tổ hợp hai tắnh trạng ựó vào một giống. Không có sự khác biệt di truyền nào gây cản trở sự tái tổ hợp của tắnh trạng hạt thon dài với các tắnh trạng ựộ trong, ựộ bạc bụng, hàm lượng amylose trong nội nhũ, kiểu cây, thời gian sinh trưởng và năng suất.
Khi theo dõi nhiều tổ hợp thấy rằng chiều dài, chiều rộng, trọng lượng hạt ở F2
tương ựương nhau và bằng giá trị trung gian giữa hai bố mẹ. Vì thế muốn hạt F2
thon dài nên chọn cả hai bố mẹ A và R thon dài.
(Takeda K, 1984) nghiên cứu di truyền kắch thước hạt trên giống lúa Fusayoshi của Nhật Bản và cho rằng tắnh trạng này do ựa gen quy ựịnh và có một gen trội không hoàn toàn kắ hiệu là Lk-f là gen chắnh. Sau ựó, trong nghiên cứu bằng phương pháp phân tắch quần thể phân li (Takeda và Kaito, 1992) ựã phát hiện ra chiều dài hạt ựược ựiều khiển bởi một gen lặn kắ hiệu lk-I (Phạm Văn Phượng, 2006).