R 5Ỗ-CATCACGGTCACCGCCATATCGGA-3Ỗ Thành phần dung dịch phản ứng PC gồm có:
4.2.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo
Khả năng kháng bệnh bạc lá của một giống trên ựồng ruộng do nhiều yếu tố quyết ựịnh, Ngoài ựặc ựiểm di truyền của giống, nó còn phụ thuộc vào nguồn bệnh ban ựầu, ựiều kiện thời tiết khắ hậuẦ Do ựó ựể dự ựoán khả năng kháng nhiễm của các mẫu giống lúa, các dòng ựẳng gen chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo 10 chủng vi khuẩn Xanthomonas Oryzae pv, Oryzae, Các chủng này ựược lựa chọn dựa trên tiêu chắ có ựộc tắnh, phổ biến ở miền Bắc Việt Nam và có thể phân biệt ựược các gen kháng, Kết quả phản ứng của các dòng ựẳng gen ựược thể hiện ở Bảng 4.6
Bảng 4.6. Phản ứng của dòng ựẳng gen với các chủng vi khuẩn
TT Chủng Dòng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỷ lệ kháng Gen kháng bệnh bạc lá 1 IRBB4 S R R S S S R S R S 6S/4R Xa4 2 IRBB7 R R R S R S R S R R 3S/7R Xa7 3 IR24 S S S S S S S S S S 10S 0
Kết quả bảng 4.6 cho thấy:
- Dòng ựẳng gen IR24, không mang gen kháng, bị nhiễm nặng cả 10 chủng vi khuẩn
- Dòng IRBB4 mang gen kháng Xa4 bị nhiễm 6 chủng và chỉ kháng ựược 4 chủng là chủng 2, 3, 7, 9
- Dòng IRBB7 mang gen Xa7 kháng ựược 7 chủng, nhiễm 3 chủng 4, 6, 8 Các mẫu giống thắ nghiệm cũng ựược lây nhiễm ựồng thời bởi các chủng vi khuẩn bạc lá trên. Sau ựó kết quả lây nhiễm trên các mẫu giống ựược so sánh với kết quả lây nhiễm trên các dòng ựẳng gen ựể dự ựoán khả năng mang gen kháng
Dựa trên tỉ lệ kháng nhiễm của các mẫu giống ựối với từng chủng (bảng 4.7) có thể xác ựịnh ựược ựộc tắnh của các chủng như sau: Chủng 6 có ựộ ựộc tắnh mạnh nhất với tỉ lệ kháng nhiễm là 13R/16M/31S; chủng 8 có ựộ ựộc tắnh cao thứ 2 với tỉ lệ kháng nhiễm là 19R/19M/22S; tiếp theo là chủng 4 (18R/22M/20S); chủng số 2 và 3 có ựộ ựộc tắnh yếu nhất với tỉ lệ kháng nhiễm là 32R/20M/8S và 33R/19M/8S.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 65
Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo của các dòng ựẳng gen ựược mô tả tại hình 4.1, hình 4.2 và hình 4.3.
Hình 4.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên ựối chứng IR24
Hình 4.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên ựối chứng IRBB7
Hình 4.3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên ựối chứng IRBB4
Chủng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Chủng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 66
Tiến hành lây nhiễm nhân tạo trên 60 mẫu giống thu ựược kết quả: 1 mẫu giống kháng ựược 9 chủng vi khuẩn bạc lá (mẫu giống 10903); có 15 mẫu giống kháng ựược 7 chủng vi khuẩn bạc lá ( mẫu giống 10124-1-2, 10132-3-3, 10132-3-5, 10222-2, 10299 và TK90); có 16 mẫu giống kháng ựược 6 chủng vi khuẩn bạc lá (mẫu 10124-1-1, 10124-2-2-2, 10739-1-1, 10762-6-1, 10810-4 và 10901); có 1 mẫu giống kháng ựược 5 chủng vi khuẩn bạc lá (mẫu N5); có 4 mẫu giống kháng ựược 4 chủng vi khuẩn bạc lá (mẫu giống 10132-3-2, 10132-3-4, 10142-1 và 10899); có 8 mẫu giống kháng ựược 3 chủng vi khuẩn bạc lá; có 7 mẫu giống kháng ựược 2 chủng vi khuẩn bạc lá; có 1 mẫu giống kháng ựược 1 chủng vi khuẩn bạc lá (mẫu giống 10900); có 6 mẫu giống không kháng ựược chủng vi khuẩn bạc lá nào
4.2.2.Kết quả PCR kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá
Theo (Phan Hữu Tôn, 2004) các nghiên cứu trước ựây thì 2 gen kháng Xa4
và Xa7 là 2 gen kháng hiệu quả ựối với các chủng bạc lá ở miền Bắc Việt Nam. Vì vậy trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi chỉ tiến hành xác ựịnh khả năng mang 2 gen kháng nói trên của các mẫu giống.
để kiểm tra khả năng mang 2 gen kháng Xa4 và Xa7 trong các mẫu giống lúa nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA và chạy PCR sử dụng các cặp mồi như ựã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp. Sau ựó, sản phẩm nhân gen ựược chạy ựiện di với sản phẩm nhân gen của các dòng ựối chứng là IR24 (không mang gen kháng), IRBB4 (mang gen kháng Xa4), IRBB7 (mang gen kháng Xa7) và so sánh kắch thước với DNA ladder 1 Kbp.
Cụ thể, trong trường hợp của gen Xa4 chúng tôi dùng chỉ thị Npb181, thì mẫu có chứa gen Xa4 có kắch thước vạch băng ựược nhân lên có chiều dài 150 bp, không chứa gen là 120 bp; trong trường hợp Xa7 sử dụng chỉ thị P3, mẫu chứa gen Xa7 có kắch thước là 297 bp, không chứa gen Xa7 là 262 bp. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.7
Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy: Hầu hết các mẫu giống ựều chứa gen Xa7, ngoại trừ các mẫu giống 10566-7, 10762-6-1, 10924, 11111 và N5 không chứa gen. Có 11 mẫu giống chứa gen Xa4 là: 10142-1, 10147, 10222-1, 10762-6-1, 10902, 10941, 10945, 10947, 1111, N5 và 10895. Có 8 mẫu giống mang cả hai gen kháng
Xa4 và Xa7 (10142-1, 10147, 10222-1, 10902, 10895, 10941, 10945, 10947) và 2 mẫu giống không mang 2 gen kháng nào là 10566-7 và 10924.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 67
Kết quả ựiện di sản phẩm PCR ựược minh họa ở Hình 4.4 và Hình 4.5
Hình 4.4. điện di sản phẩm PCR gen Xa4 sử dụng cặp mồi Npb181
M. Ladder; 1. IR24, ựối chứng âm; 2. Mẫu giống 10883; 3. Mẫu giống 10884-3; 4. Mẫu giống 10898; 5. Mẫu giống 10899; 6. Mẫu giống 10903; 7. Mẫu giống 10907; 8. Mẫu giống 10898; 5. Mẫu giống 10899; 6. Mẫu giống 10903; 7. Mẫu giống 10907; 8. Mẫu giống 10921-1; 9. Mẫu giống 11079; 10. Mẫu giống 11111; 11.Mẫu giống N2-1