Phương pháp: đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.
Nguyên tắc: mẫu thử được cho vào thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật, tạo thành vòng vô khuẩn. Hoạt tính kháng khuẩn của mẫu thử được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn.
Mẫu thử: dung dịch EB12 50µg/ml, dung dịch Eb12 100 µg/ml
Dung dịch kháng sinh penicillin 28UI/ml Gentamycin 20µg/ml
Tiến hành:
- Cấy vi sinh vật kiểm định vào môi trường thạch dinh dưỡng với mật độ 106 tế bào/100 ml môi trường. Đổ môi trường vào đĩa petri, chờ đông đặc.
- Đục các giếng thạch có kích thước bằng nhau trên đĩa petri, vị trí các giếng cách xa nhau và cách xa thành đĩa petri.
- Bổ sung các dung dịch mẫu thử vào các giếng thạch với thể tích 0,1ml/1 giếng.
- Ủ các đĩa petri ở 30°C trong 18-24 giờ.
- Đọc kết quả đường kính vô khuẩn của các mẫu thử.
Đánh giá kết quả: đường kính vòng vô khuẩn được xác định như sau: D = Do – d
D : đường kính vòng vô khuẩn (mm).
Do: đường kính vòng ngoài của vòng vô khuẩn trên đĩa thạch (mm). d: đường kính giếng thạch (mm).
2.3.2.Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của kem EB12 trên bỏng thực nghiệm
2.3.2.1.Triển khai mô hình gây bỏng nhiệt thực nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội. Gây bỏng nhiệt cho thỏ theo phương pháp đã được Pocidalo J.J (1955) và Hladovec J. (1961) mô tả với dụng cụ gây bỏng là bình kim loại hình trụ rỗng, có thể chứa nước, có tay cầm cách nhiệt. Thỏ được cạo sạch lông hai bên sống lưng, gây mê bằng thiopental natri liều 25 mg/kg. Sau đó gây bỏng bằng cách áp bình kim loại có nhiệt độ 100°C vào da lưng thỏ dưới áp lực 1kg, trong các khoảng thời gian 35, 40 và 50 giây. Sau 3 ngày, quan sát đại thể các vết bỏng, đồng thời lấy mẫu mô bệnh học tại mô tổn thương, quan sát vi thể, xác định độ sâu tổn thương, lựa chọn thời gian gây bỏng thích hợp để tiến hành nghiên cứu.
2.3.2.2.Nghiên cứu tác dụng điều trị tại chỗ của kem EB12 trên bỏng thực nghiệm
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu tác dụng của EB12 trên bỏng nhiệt thực nghiệm.
-8 Gây bỏng -3 0 7 14 21 Ngày Nuôi ổn định Xét nghiệm vi thể Đo diện tích vết bỏng
Lấy mẫu vi khuẩn tại bề mặt vết bỏng
Bôi thuốc
Sau khi lựa chọn thời gian gây bỏng thích hợp, gây bỏng cho thỏ như đã mô tả ở
mục 2.3.2.1, với thời gian gây bỏng 35 giây, phân thỏ thành 4 lô, nhốt riêng mỗi
con một chuồng:
Lô 1 (n=9): bôi tá dược kem EB12 (Tá dược). Lô 2 (n=10): bôi kem sulfadiazin-bạc 1% ( SSD). Lô 3 (n=10): bôi kem EB12 100µg/g.
Lô 4 (n=9): bôi kem EB12 1000µ/g.
Tất cả các thỏ đều được bôi mẫu thử từ sau khi gây bỏng 3 ngày đến khi liền sẹo, mỗi ngày 2 lần vào khoảng 8 giờ sáng và 16 giờ chiều, lượng mẫu thử 0,03g/cm2/lần. Vết thương để hở, không băng.
Chỉ tiêu theo dõi tại chỗ vết bỏng
Đại thể
Tình trạng vết bỏng: sung huyết, phù nề, tiết dịch, hoại tử, sự mọc mô hạt, quá trình biểu mô hóa. Các vết bỏng được theo dõi, ghi chép và đánh giá hàng ngày dựa trên thang điểm sau:
Bảng 2.1: Thang điểm đánh giá tình trạng đại thể tại vết bỏng
Điểm 0 điểm 1 điểm 2 điểm 3 điểm
Lượng dịch tiết Khô Ướt, không có mủ Ướt, có mủ trắng Độ rộng vết
bỏng Không Ít Trung bình Nhiều
Tình trạng ổ loét
Không loét hoặc đã tróc vảy, liền sẹo
Loét nông, khô hoặc chưa tróc vảy
Loét nông, ướt
Loét sâu, ướt Mức độ
sung huyết Không Ít Trung bình Nhiều Mức độ phù
nề Không Ít Trung bình Nhiều
Mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng: đo diện tích vết bỏng vào các ngày trước khi bôi mẫu thử, ngày thứ 7, 14, 21 sau khi bôi mẫu thử bằng giấy bóng kính vô trùng.
Mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng được tính theo công thức:
Trong đó:
X: mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng (%).
S0: diện tích vết bỏng lúc chưa bôi mẫu thử (cm2).
St: diện tích vết bỏng vào ngày thứ t sau khi bôi mẫu thử (cm2).
Thời gian liền vết bỏng: được tính từ khi gây bỏng đến khi lớp vảy bong hoàn toàn, bề mặt vết bỏng đã được bao phủ bởi một lớp biểu mô mới.
Vi thể
Hình ảnh mô bệnh học: Lấy bệnh phẩm tại mô tổn thương tại hai vị trí: giữa vết bỏng và rìa vết bỏng vào ngày thứ 21 sau khi dùng mẫu thử. Cố định mẫu bệnh phẩm bằng dung dịch Bouin, vùi trong paraffin. Cắt lát dày 5-7mm, nhuộm tiêu bản bằng hematoxylin-eosin (HE). Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40, 100 và 400 lần, nhận xét sự biến đổi tế bào và cấu trúc mô.
Xét nghiệm vi khuẩn và nấm trên bề mặt vết bỏng
Các xét nghiệm VK và vi nấm trên bề mặt vết bỏng được thực hiện tại khoa Cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc Gia, theo kỹ thuật của Ivanov N.A và Danilova.
Thời điểm lấy mẫu: là ngày trước khi dùng mẫu thử (ngày thứ 3 sau khi gây bỏng, N0), ngày thứ 7 (N7), ngày thứ 14 (N14), ngày thứ 21 (N21) sau khi dùng mẫu thử.
Phương pháp lấy mẫu: Các mẫu bệnh phẩm của cùng một vết bỏng ở những
ngày khác nhau được lấy tại cùng một vị trí trên vết bỏng đó. Sử dụng miếng giấy trong vô khuẩn được đục sẵn lỗ có diện tích 1cm x 1cm, đặt lên bề mặt vết bỏng chưa được lau rửa. Dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối sinh lý vô khuẩn, lăn nhẹ trên bề mặt vết bỏng, trong vùng đã đục lỗ của miếng giấy. Lăn đều, chậm sao cho tăm bông tiếp xúc hết với diện tích tổn thương bỏng trong vòng 20s. Cho tăm bông vào ống nghiệm có chứa sẵn 2ml nước muối sinh lý, lắc nhẹ trong vòng 1 phút, đậy kín và mang đi xét nghiệm.
Định loại vi khuẩn: pha loãng dung dịch trên với các tỷ lệ khác nhau, tùy theo số lượng VK nhiều hay ít. Dùng micropipet lấy 10µl dung dịch nước muối sinh lý có chứa VK đã pha loãng, cấy ria đều lên đĩa môi trường thạch dinh dưỡng. Ủ môi trường ở 37°C trong 24- 48 giờ, cấp khí bình thường. Sau đó, dựa trên đặc điểm khuẩn lạc để định danh VK và vi nấm.
Xác định số lượng 2 loài VK chủ yếu ở vết bỏng:S. aureus, P. aeruginosa có trong 1 cm2 diện tích vết bỏng: từ mỗi VK mọc lên một khuẩn lạc, do dó số VK ban đầu tương ứng với số khuẩn lạc. Đếm số khuẩn lạc đặc trưng của từng loài VK, nhân với tỷ lệ pha loãng.