Đường kính vòng vô khuẩn của các mẫu thử trong thí nghiệm như sau:
Bảng 3.1: Đường kính vòng vô khuẩn các mẫu thử đối với các loài vi khuẩn (mm)
VK/ VN EB12 50µg/ml EB12 100µg/ml Penicillin
28 UI/ml Gentamycin 20µg/ml S. aureus 9,26 ± 2,53 10,17 ± 2,81 20,47±0,42 Không thử B. subtilis 6,01± 1,29 5,65 ± 0,16 - Không thử B. pumilus 7,10 ± 1,62 7,61 ± 1,00 - Không thử B. cereus - - 16,22±0,12 Không thử S. lutea - - Không thử S. flexneri 6,11 ± 1,07 5,71 ± 1,19 Không thử 12,34±0,61 P. mirabilis 5,71 ± 1,42 5,77 ± 1,24 Không thử 17,27±0,42 E. coli - - Không thử 15,40±0,47 S. typhi - - Không thử 17,50±0,33 P. aeruginosa - - Không thử 10,65±1,27
C. albican - - Không thử Không thử
Aspergic sp. - - Không thử Không thử
Mốc xanh - - Không thử Không thử
Mốc đen - - Không thử Không thử
dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Bacillus subtilis, S. aureus, Bacillus pumilus, Bacillus pumilus, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, tuy nhiên đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh chứng tương ứng, không có tác dụng ức chế đối với các vi khuẩn và vi nấm: E.coli, Samolnella typhi, P. aeruginosa, Bacillus cereus, Saracina lutea, C. albican, Aspergic sp. , nấm Mốc xanh, nấm Mốc đen.
3.3. TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ TẠI CHỖ CỦA KEM EB12 TRÊN BỎNG
NHIỆT THỰC NGHIỆM
3.3.1. Tình trạng chung của thỏ
Ngày đầu sau khi gây bỏng, thỏ mệt, ít hoạt động, thường nằm yên, ăn uống kém. Vài ngày sau, thỏ nhanh nhẹn dần, ăn uống tốt hơn. Khoảng 2 tuần sau khi điều trị, thỏ nhanh nhẹn, ăn uống và hoạt động bình thường.
3.3.2. Diễn biến đại thể tại vết bỏng
3.3.2.1.Diễn biến chung
Ngay sau khi gây bỏng, vết bỏng có màu trắng ngà, không phồng rộp, có ranh giới rõ ràng với vùng da lành. Khoảng 1-2 giờ sau, rìa xung quanh vết bỏng nhìn rõ quầng sung huyết.
Ngày thứ 3 sau khi gây bỏng, vết bỏng bắt đầu loét và xuất hiện hoại tử ướt. Sau khi bôi mẫu thử 7 ngày, các vết bỏng vẫn ướt, có mủ trắng, chưa thấy có sự khác biệt giữa các lô. Một số hình ảnh vết bỏng vào ngày thứ 3 sau khi gây bỏng và ngày thứ 7 điều trị được trình bày ở hình 3.6.
Sau 14 ngày, đa số vết bỏng co lại, giảm tiết dịch, một số vết bỏng còn ướt và có mủ. Một số vết bỏng ở lô EB12 1000µg/g bắt đầu rụng mô hoại tử. Sau 21 ngày điều trị, các vết bỏng hết mủ, khô, diện tích được thu hẹp đáng kể. Một số vết bỏng thuộc lô sulfadiazin-bạc 1% và lô EB12 1000µg/g bắt đầu bong vảy và liền sẹo. Một số hình ảnh vết bỏng sau khi bôi mẫu thử 14 và 21 ngày được minh họa ở hình 3.7.
Ngày 0 Ngày 7
Lô tá dược
Lô SSD
Lô EB12 100µg/g
Lô EB12 1000µg/g
Ngày 14 Ngày 21
Lô tá dược kem EB12
Lô SSD
Lô EB12 100µg/g
Lô EB12 1000µg/g
3.3.2.2.Đánh giá chi tiết tình trạng đại thể vết bỏng
Các vết bỏng được theo dõi, đánh giá hàng ngày. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.2: Kết quả đánh giá diễn biến đại thể tại vết bỏng (điểm)
Lô Mẫu thử N0 N7 N14 N21 1 Tá dược (n=9) 9,12 ± 1,72 10,50 ± 0,75 1,75 ± 0,89 1,13 ± 0,99 8,60 ± 1,95 10,00 ± 0,81 1,80 ± 0,79 1,00 ± 0,82 2 Sulfadiazin-bạc 1% (n=10) p = 0,63 p = 0,24 p = 0,97 p = 0,90 9,00 ± 1,49 10,00 ± 0,81 1,80 ± 0,92 1,20 ± 0,42 3 EB12 100µg/g (n=10) p = 0,89 p = 0,24 p = 0,76 p = 0,70 9,00 ± 2,07 10,00 ± 0,75 1,50 ± 0,53 0,87 ± 0,83 4 EB12 1000µg/g (n=9) p = 0,88 p = 0,23 p = 0,44 p = 0,72 Trong đó p: sự khác biệt so với lô bôi tá dược kem EB12.
Nhận xét:
- Tại thời điểm chưa điều trị (N0): tình trạng các vết bỏng ở các lô giống nhau (p> 0,05).
- Trong 7 ngày đầu điều trị, các vết bỏng đều diễn biến nặng dần lên, loét sâu và rộng, tăng dịch tiết, tăng mủ. Điểm đánh giá mức độ bỏng ở các lô đều tăng tuy nhiên không có sự khác biệt giữa các lô.
- Ngày thứ 14 sau khi điều trị (N7), tình trạng các vết bỏng đã được cải thiện đáng kể, tuy nhiên chưa có sự khác biệt giữa các lô.
- Đánh giá tình trạng đại thể vết bỏng vào ngày thứ 21 sau khi điều trị (N21) cho thấy các vết bỏng lô EB12 1000µg/g được cải thiện hơn so với lô bôi tá dược (0,87 so với 1,13), tuy nhiên sự khác biệt chưa đạt mức ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
3.3.2.3.Mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng
Diện tích vết bỏng được đo vào các ngày: trước khi điều trị (N0), ngày thứ 7 (N7), ngày thứ 14 (N14) và ngày thứ 21 (N21) sau khi điều trị. Mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng (%) ở các ngày N7, N14 , N21 so với trước khi điều trị được thể hiện ở
bảng sau: Bảng 3.3: Mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng Lô Mẫu thử n N7 N14 N21 1 Tá dược 9 X(%) 34,29 ± 13,30 62,96 ± 13,40 89,02 ± 8,04 X(%) 30,99 ± 9,63 67,04 ± 17,20 86,49 ± 12,05 2 SSD 10 p p = 0,67 p = 0,54 p = 0,59 X(%) 36,22 ± 19,10 67,33 ± 11,39 85,99 ± 10,89 3 EB12 100µg/g 10 p 0,80 p = 0,51 p = 0,52 X(%) 27,88 ± 19,9 71,12 ± 12,9 90,42 ± 9,48 4 EB12 1000µg/g 9 p p = 0,42 p = 0,24 p = 0,81 Trong đó p: sự khác biệt khi so với lô bôi tá dược.
Kết quả ở bảng trên cho thấy diện tích vết bỏng được thu hẹp dần trong quá trình điều trị. Sau 21 ngày dùng thuốc, diện tích các vết bỏng được thu hẹp 85-90%. Tuy nhiên mức độ thu hẹp diện tích vết bỏng ở các lô không có sự khác biệt (p> 0,05).
3.3.2.4.Thời gian liền vết bỏng
Các vết bỏng được quan sát và ghi chép diễn biến hàng ngày. Vết bỏng được coi là liền hoàn toàn khi đã bong lớp vảy phía trên, bề mặt vết bỏng được bao phủ bởi một lớp biểu mô mới. Thời gian liền vết bỏng trung bình của các lô được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.4: Thời gian liền vết bỏng
Lô Mẫu thử N Thời gian liền vết bỏng (ngày) P 1 Tá dược kem EB12 9 25,00 ± 1,06
2 Sulfadiazin-bạc 1% 10 23,37 ± 2,70 0,60
3 EB12 100µg/g 10 25,42 ± 1,39 0,98
4 EB12 1000µg/g 9 24,33 ± 3,38 0,99
Trong đó p: sự khác biệt so với lô bôi tá dược kem EB12.
Kết quả trên cho thấy thời gian liền vết bỏng ở lô bôi sulfadiazin-bạc 1% và lô bôi EB12 1000µg/g có giảm so với lô bôi tá dược kem EB12, tuy nhiên sự khác biệt
không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
3.3.3. Diễn biến cấu trúc vi thể tại vết bỏng
Một số hình ảnh vi thể tại vết bỏng vào ngày thứ 21 sau khi điều trị:
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.8: Hình ảnh mô hạt tái tạo, có viêm mạn tính ( nhuộm HE)
(a) Lô tá dược kem EB12 (x400) (b)Lô SSD (x400)
(c) Lô EB12 100µg/g (x100) (d) Lô EB12 1000µg/g (x400)
(a) (b)
Hình 3.9: Hình ảnh tổn thương bỏng đang tái tạo (nhuộm HE, x400)
(a) Lớp thượng bì nông, có tế bào viêm thâm nhập ở lô SSD
(b) Nang lông và tuyến mồ hôi dưới lớp thượng bì ở vết bỏng bôi EB12 1000µg/g
Hình ảnh vi thể tại vết bỏng cho thấy: các mô tổn thương đều còn tồn tại các tế bào viêm như: bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, mô bào. Mô hạt
điển hình với mạch máu tân tạo, sợi liên kết và các tế bào xơ non đã xuất hiện ở các vết bỏng. Các tế bào lớp thượng bì đã được hình thành ở các vết bỏng thuộc lô sulfadiazin bạc 1%, EB12 100µg/g, EB12 1000µg/g, tuy nhiên chưa xuất hiện ở lô bôi tá dược kem EB12.
3.3.4. Diễn biến của quần thể vi khuẩn tại vết bỏng
3.3.4.1.Các loài vi khuẩn phân lập được tại vết bỏng
Tỷ lệ các VK phân lập được qua các lần cấy khuẩn:
Bảng 3.5 : Tỷ lệ các vi khuẩn phân lập được tại vết bỏng
VK Số lần phân lập được % tỷ lệ phân lập được (%)
S. aureus 75 73,53 P. aeruginosa 17 16,67 E. coli 3 2,94 E. cloacea 4 3,92 K. pneumoniae 2 1,96 Ent. Faecium 2 1,96 Str. Agalactiae 2 1,96 Bacillus spp. 3 2,94 Pro. Mirabillis 2 1,96 Aci. Lowfii 3 2,94
Nhận xét: kết quả trên cho thấy các loài VK phân lập được nhiều nhất là S. aureus 73,53%, P. aeruginosa 16,67% và các trực khuẩn đường ruột (E. coli, E. cloacea, K. pneumoniae ) 8,82%.
3.3.4.2.Diễn biến số lượng loài vi khuẩn gây bệnh chủ yếu tại vết bỏng
Các loài VK gây bệnh chủ yếu ở vết bỏng là S. aureus, P. aeruginosa. Qua các lần cấy khuẩn ở các thời điểm: 3 ngày sau khi gây bỏng (N0), 7 ngày sau khi điều trị (N7) và 14 ngày sau khi điều trị (N14), tỷ lệ xuất hiện của các VK trên là S. aureus
(73,53%), P. aeruginosa (16,67%). Số liệu về P.aeruginosa không đủ để xử lý thống kê. Số lượng VK S. aureus qua các lần lấy mẫu như sau:
Lô Mẫu thử N N0 N7 N14 1 Tá dược 9 1412,00 ± 831,70 1185,00 ± 358,80 166,00 ± 61,30 1437,00 ± 839,50 161,30 ± 62,80 113,20 ± 31,30 2 SSD 10 p2-1 = 0,713 p2-1 = 0,001 p2-1 = 0,635 842,00 ± 545,94 477,00 ± 396,70 167,00 ± 41,00 p3-1 = 0,368 p3-1 = 0,007 p3-1 = 0,792 3 EB12 100µg/g 10 p3-2 = 0,631 p3-2 = 0,739 p3-2 = 0,315 2112,80 ± 1055,60 254,38 ± 127,01 202,70 ± 89,25 p4-1 = 0,662 p4-1 = 0,020 p4-1 = 0,950 p4-2 = 0,360 p4-2 = 0,965 p4-2 = 0,633 4 EB12 1000µg/g 9 p4-3 = 0,146 p4-3 = 0,829 p4-3 = 0,897 Trong đó: px-y: sự khác biệt về số lượng VK ở lô x so với lô y.
Kết quả trên cho thấy:
- Số lượng VK S. aureus trên 1cm2 diện tích vết bỏng tại thời điểm trước khi điều trị ở các lô tương đương nhau (p> 0,05).
- Sau khi điều trị, số lượng VK ở các lô sulfadiazin-bạc 1%, EB12 100µg/g và EB12 1000µg/g giảm nhanh hơn ở lô bôi tá dược. Sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê tại thời điểm 7 ngày sau khi bôi mẫu thử (p<0,05). Điều này cho thấy kem EB12 100µg/g và EB12 1000µg/g có tác dụng kháng khuẩn đối với S. aureus khi điều trị tại chỗ vết bỏng.
- Số lượng VK S. aureus ở lô EB12 100µg/g và EB12 1000µg/g so với lô sulfadiazin-bạc 1% tại các thời điểm không có sự khác biệt (p> 0,05), do đó tác dụng kháng khuẩn của EB12 100µg/g và EB12 1000µg/g tương đương với sulfadiazin-bạc 1%.
Vậy kem EB12 hàm lượng 100µg/g và 1000µg/g có tác dụng kháng khuẩn trên
S. aureus khi điều trị tại chỗ vết bỏng, tác dụng kháng khuẩn này tương đương kem sulfadiazin-bạc 1%.
Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. VỀ MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU
4.1.1. Lựa chọn mô hình nghiên cứu
Trong số các tác nhân gây bỏng thực nghiệm, nhiệt độ có ưu điểm hơn so với dòng điện và hóa chất bởi dễ dàng kiểm soát độ sâu và diện tích vết bỏng, có thể tạo ra những tổn thương đồng nhất [53]. Hơn nữa, các mô hình bỏng nhiệt áp dụng được trên nhiều loại động vật, dụng cụ đơn giản, dễ tiến hành [53]. Trên thực tế, bỏng nhiệt hay gặp nhất, chiếm 84-94% các nguyên nhân gây bỏng [17], [18], chưa kể bỏng hóa chất và bỏng điện cũng có một phần cơ chế do nhiệt. Đây là những lý do để chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu trên mô hình bỏng nhiệt thực nghiệm.
Trong số các phương pháp gây bỏng nhiệt thường dùng, phương pháp sử dụng bình kim loại tạo ra được những tổn thương đồng nhất, có thể tùy chọn các thông số trong quá trình gây bỏng để tạo ra vết bỏng có diện tích và độ sâu mong muốn [53]. Hơn nữa phương pháp này có dụng cụ đơn giản, dễ tiến hành, có thể triển khai trên nhiều loài động vật khác nhau [53]. Ở nước ta, phương pháp này đã được áp dụng thành công trong các nghiên cứu của Nguyễn Thị Tỵ (1989) [22], Vũ Thị Ngọc Thanh (2003) [14] và Trần Thị Lự (2011) [10].
4.1.2. Lựa chọn thời gian gây bỏng
Trên cơ sở các công bố trước đây của Nguyễn Thị Tỵ (1989) [22], Vũ Thị Ngọc Thanh (2003) [14] và Trần Thị Lự (2011) [10] tiến hành gây bỏng tại Học viện Quân Y, chúng tôi đã thiết kế dụng cụ gây bỏng có cấu tạo tương tự dụng cụ gây bỏng của Học Viện Quân Y, sử dụng cho mô hình gây bỏng ở nhiệt độ 100°C dưới áp lực 1 kg. Đồng thời, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm để lựa chọn thời gian tiếp xúc thích hợp để tạo ra tổn thương bỏng có diện tích và độ sâu như mong muốn.
Nhiệt độ gây bỏng được cố định ở 100°C. Dụng cụ gây bỏng được làm nóng bằng cách ngâm vào bể cách thủy. Nhờ có nhiệt dung riêng lớn, nước bên trong bình kim loại giúp cho nhiệt độ của dụng cụ hằng định trong suốt thời gian gây bỏng.
Áp lực lên vùng da gây bỏng được cố định ở mức 1kg, sử dụng chính trọng lượng của dụng cụ gây bỏng. Trong quá trình thực hiện, kỹ thuật viên chỉ tác dụng lực để giữ dụng cụ gây bỏng tiếp xúc với da, do đó áp lực lên da động khi gây bỏng ở các vết bỏng đồng đều, không phụ thuộc ý muốn chủ quan của kỹ thuật viên.
Thời gian: động vật được gây bỏng trong những khoảng thời gian 35 giây, 40 giây và 50 giây.
Kết quả phân tích tình trạng đại thể và hình ảnh vi thể tại vết thương bỏng vào ngày thứ 3 sau khi gây bỏng cho thấy: Gây bỏng ở thời gian 35 giây tạo ra vết bỏng độ III nông, vùng da xung quanh không có phản ứng viêm. Thời gian gây bỏng 40 giây tạo ra vết bỏng độ III sâu, da vùng xung quanh tổn thương viêm nhẹ. Với thời gian gây bỏng 50 giây, vết bỏng tạo ra sâu độ IV, hoại tử sâu, viêm xâm nhập tới lớp mỡ và cơ vân, vùng da xung quanh có phản ứng viêm vừa.
Với mục đích tạo ra những vết bỏng sâu độ III phục vụ nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn thời gian gây bỏng là 35 giây để tạo ra tổn thương có độ sâu phù hợp, đồng thời không làm ảnh hưởng đến tình trạng toàn thân của động vật thí nghiệm.
4.2. VỀ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM IN VITRO CỦA EB12
Kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy dung dịch EB12 nồng độ 50 µg/ml và 100 µg/ml có tác dụng ức chế sự phát triển của các VK Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Shigella flexneri và Proteus mirabilis, không có tác dụng ức chế đối với các vi khuẩn và vi nấm: E.coli, Samolnella typhi, P. aeruginosa, Bacillus cereus, Saracina lutea, C. albican, Aspergic sp. , nấm Mốc xanh, nấm Mốc đen. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số tác giả trong và ngoài nước:
Ifesan và cộng sự (2009) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của E. americana trong đó eleutherin và isoeleutherin là các thành phần có hoạt tính chính. Kết quả cho thấy các dịch chiết này có tác dụng ức chế sự phát triển của các VK B. subtilis, S. aureus và một số VK khác như B. cereus, B. licheniformis , không có tác dụng trên P. aeruginosa và E. coli [41], [42].
hành tác dụng kháng khuẩn đối với các VK S. aureus, S. faecalis, Aeromonas hydrophila, tác dụng yếu hơn trên P. aeruginosa và yếu nhất trên E. coli [5]. Kết quả này phù hợp với kết quả của chúng tôi, mẫu thử EB12 ở các nồng độ 50µg/ml và 100µg/ml không thể hiện tác dụng ức chế đối với P. aeruginosa và E. coli trong khi ức chế rõ rệt S. aureus.
Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy dịch chiết của Sâm đại hành có tác dụng kháng khuẩn đối với các VK tương tự [9], [11], [24], [62].