Nguyên tắc định lượng enzym AChE:
Phép thử tác dụng ức chế enzym AChE bằng phương pháp đo quang dựa trên nguyên tắc của Ellman và cộng sự (1961): cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic. Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra acid 5-thio-2-nitrobenzoic (RS-) có màu vàng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm [30].
Động vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng đã được nghiên cứu trong 2 thí nghiệm trên.
Một ngày sau khi kết thúc test ORT, chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng sự [30].
Cách tiến hành thí nghiệm:
- Vỏ não chuột sau khi được tách trong điều kiện lạnh (hộp đá) sẽ được đặt ngay vào trong bình chứa nitơ lỏng để bảo quản tạm thời, sau đó cất trong tủ lạnh âm sâu (-800C) để bảo quản lâu dài cho đến khi tiến hành định lượng enzym AChE.
- Khi tiến hành định lượng, cân khối lượng mô (não) ở trên, thêm 10 lần thể tích dung dịch đệm phosphat có chứa 1% triton X-100, nghiền đồng nhất. Ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Hút lấy dịch nổi và sử dụng như nguồn enzym. - Chuẩn bị hỗn hợp gồm: Nguồn enzym: DTNB 10 mM: ACCI 30 mM: Đệm phosphat, pH=8: 50 µl 20 µl 20 µl 160 µl
- Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm phosphat, pH = 8,0; dung dịch enzym vào từng giếng của đĩa 96 giếng. Hỗn hợp các dung dịch này được
trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. Sau đó dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ACCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều, tiếp tục ủ hỗn ở 250C trong 15 phút.
- Lắc đều bằng máy lắc, đo ngay ở bước sóng 412 nm. Hoạt độ enzym AChE được tính toán dựa trên độ hấp thụ tại bước sóng 412 nm. Mỗi thử nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần được làm trên 3 giếng, mỗi giếng được máy tự động đo giá trị mật độ quang (OD) 10 lần. Giá trị tính toán là hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột (đơn vị: nmol/phút/mg não chuột) và % giảm hoạt độ enzym AChE của các lô thử so với lô chứng bệnh lý.
- Công thức tính hoạt độ enzym AChE:
Hoạt độ AChE =OD x 1000 x 2
13600 x
1,5 x 32
100 x 1000 (nmol/phút/mg não chuột) Trong đó: OD là mật độ quang trung bình của các mẫu sau khi đã trừ đi mật độ quang của mẫu trắng
(Nguồn: Trường Đại học Toyama, Nhật Bản)
- Công thức tính % giảm hoạt độ enzym AChE so với lô chứng bệnh lý:
% giảm hoạt độ AChE so với nhóm bệnh lý=
=Hoạt độ AChE nhóm bệnh lý− Hoạt độ AChE nhóm thử
Hoạt độ AChE nhóm bệnh lý x100%