- l-THP được phân tán đồng nhất trong Tween 80 1% để đạt được hỗn dịch có nồng độ mong muốn (0,001% và 0,003%).
- Tacrin được hòa tan trong tween 80 1% để đạt được nồng độ mong muốn (0,025%).
- Các dung dịch và hỗn dịch thuốc trên được dùng cho chuột theo đường uống, riêng dung dịch tacrin được dùng theo đường tiêm màng bụng.
- Các dung dịch ACCI 30 mM và DTNB 10 mM pha trong đệm phosphat, pH = 7,2.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các thí nghiệm trong nghiên cứu và điều kiện nghiên cứu
Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ in vivo bằng test MWM Nghiên cứu khả năng ức chế enzym AChE ex vivo Nghiên cứu khả năng ức chế enzym AChE in vitro Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ in vivo bằng test ORT l - tetrahydropalmatin
Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh, tại khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu. Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 7h30’-18h hàng ngày. Với test MWM và test ORT, cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì ở mức thấp nhất có thể nhìn thấy (khoảng 120 lux). Hai nghiên cứu còn lại cũng được tiến hành ở điều kiện ánh sáng tối thiểu tương tự khi xử lý mẫu và khi đo độ hấp thụ quang.
2.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ in vivo bằng test mê lộ nước Morris Morris
2.2.2.1. Phương pháp gây sa sút trí nhớ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện kỹ thuật gây sa sút trí nhớ bằng cách gây thiếu máu não cục bộ tạm thời theo mô hình thắt 2 động mạch cảnh kết hợp với rút máu đuôi chuột [46], [52]:
Chuột nhắt trắng sau khi đã nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm 7 ngày được tiến hành phẫu thuật:
- Gây mê chuột bằng pentobarbital (liều 50 mg/kg) tiêm màng bụng. - Sau khi chuột bị gây mê, bộc lộ 2 động mạch cảnh.
+ Đối với những lô thử thuốc: kẹp động mạch cảnh bằng kẹp động mạch trong 30 phút, đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút 0,2 ml máu đuôi chuột trong thời gian kẹp động mạch.
+ Đối với lô chứng sinh lý: Chuột được mổ bộc lộ 2 động mạch nhưng không kẹp động mạch và không rút máu đuôi.
- Sau khi phẫu thuật, chuột được ủ ấm ở 370 C cho đến khi tỉnh dậy.
Hình 2.4. Sơ đồ phẫu thuật chuột trong thí nghiệm gây thiếu máu não cục bộ tạm thời
2.2.2.2. Test mê lộ nước Morris
Nguyên tắc:
MWM là mô hình đánh giá khả năng học tập không gian cho động vật gặm nhấm, định hướng từ vị trí bắt đầu, xung quanh chu vi của một khu vực bơi để xác định vị trí một bến đỗ nhằm tránh khỏi ngập nước dựa trên các dấu hiệu gợi ý ngoại vi [22], [26], [42].
Thiết kế thí nghiệm:
Chuột được chia làm 5 lô thí nghiệm như sau (bảng 2.2):
Bảng 2.2. Phân lô nghiên cứu đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ in vivo
Lô n Mẫu thử/liều dùng Phác đồ dùng thuốc
Chứng sinh lý 10
Uống dung dịch Tween 80 1%
- 1 lần/ngày x 3 ngày trước khi phẫu thuật
- 1 giờ trước khi phẫu thuật - 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày
Chứng bệnh lý 9
l-THP liều thấp 10 Uống hỗn dịch l-THP liều 0,1 mg/kg
l-THP liều cao 11 Uống hỗn dịch l-THP
liều 0,3 mg/kg
Tacrin 10 Tiêm màng bụng
tacrin liều 2,5mg/kg
- 30 phút trước khi phẫu thuật - 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm hàng ngày
2 ngày sau khi tiến hành phẫu thuật gây thiếu máu cục bộ tạm thời, chuột bắt đầu được tiến hành đánh giá hành vi bằng test MWM. Tổng thời gian chuột phải học là 7 ngày. Các bài tập cụ thể và thời gian như sau [56]:
- Bài tập nhìn thấy bến đỗ:
2 ngày sau phẫu thuật, chuột được học bài đầu tiên là bài tập nhìn thấy bến đỗ (visible trial). Bến đỗ được đặt cao hơn mặt nước 1 cm. Mỗi chuột được bơi để tìm thấy bến đỗ 1 lần. Nếu trong 60 giây, chuột tìm thấy bến đỗ, chuột sẽ được ở lại trong 10 giây. Nếu trong 60 giây chuột không tìm thấy bến đỗ, chuột sẽ được hướng dẫn tìm đến bến đỗ và ở lại trong 15 giây. Sau đó chuột được lau khô, sưởi ấm và đưa về chuồng.
- Bài tập không nhìn thấy bến đỗ:
Từ ngày thứ 3 tới ngày thứ 7 sau khi phẫu thuật kẹp động mạch cảnh và rút máu đuôi, chuột được tập nhớ không gian với bài tập không nhìn thấy bến đỗ (training trial), khi bến đỗ được đặt dưới mặt nước 1 cm. Mỗi ngày chuột được tập 3 lần, mỗi lần ở một trong ba góc phần tư còn lại trong mê lộ nước. Nếu 60 giây chuột không tìm thấy bến đỗ, chuột sẽ được hướng dẫn cách tìm bến đỗ và ở lại bến đỗ 20 giây. Khoảng cách giữa các lần tập là 1 phút, trong thời gian này chuột được lau khô và sưởi ấm. Toàn bộ quá trình sẽ được ghi lại bằng camera, thời gian tiềm tàng chuột tìm thấy bến đỗ sẽ được phần mềm tính toán. Số liệu mỗi ngày được tính toán bằng giá trị trung bình thời gian 3 lần tập đối với mỗi chuột.
- Bài tập không có bến đỗ:
Ngày thứ 8 sau khi phẫu thuật kẹp động mạch cảnh và rút máu đuôi, chuột sẽ được tập thử lại trí nhớ (probe trial). Trong bài tập này, bến đỗ được bỏ ra ngoài, chuột được bơi trong mê lộ một lần duy nhất trong 60 giây. Chuột sẽ nhớ lại vị trí của bến đỗ và có xu hướng bơi lâu hơn tại góc phần tư của mê lộ đặt bến đỗ ở những bài tập trước. Camera sẽ ghi lại và phân tích thời gian chuột bơi ở mỗi góc phần tư của mê lộ.
2.2.3. Đánh giá tác dụng cải thiện sa sút trí nhớ bằng test nhận diện đồ vậtNguyên tắc: Nguyên tắc:
Các lô chuột sau khi đã được điều trị với thuốc (mẫu thử) sẽ được đánh giá khả năng cải thiện trí tạm thời (short term memory) (trí nhớ ngắn hạn không liên quan đến vị trí không gian tương ứng với trí nhớ phân đoạn của con người) bằng mô
hình thử nghiệm nhận dạng vật thể vào ngày thứ 14 sau khi tiến hành phẫu thuật thắt động mạch cảnh. Mô hình này được thực hiện theo phương pháp của tác giả Yamada và cộng sự [53].
Phương pháp tiến hành:
- Một ngày trước khi tiến hành test ORT (ngày thứ 13 sau khi phẫu thuật), chuột được đặt vào hộp, cho phép chuột tự do khám phá không gian mới. Ngày tiếp theo, test ORT được tiến hành. Test ORT gồm có 2 giai đoạn, bao gồm giai đoạn mẫu (sample phase) và giai đoạn kiểm tra (test phase). Trong giai đoạn mẫu, mỗi chuột được đặt vào hộp ngày hôm trước, có bổ sung thêm 2 đồ vật O1 và O2. Chuột được phép khám phá tự do 2 đồ vật này trong 5 phút. Giai đoạn kiểm tra được tiến hành sau khi thực hiện giai đoạn luyện tập 30 phút. Ở giai đoạn này, một trong hai đồ vật O1 và O2 trong hộp được thay thế bởi đồ vật O3. Chuột cũng được được phép khám phá những đồ vật này trong 5 phút, giống ở giai đoạn mẫu (hình 2.6). Thời gian chuột khám phá các đồ vật sẽ được ghi lại và tính toán bằng phần mềm do giáo sư Kinzo Matsumoto, Trường Đại học Toyama, Nhật Bản cung cấp.
Hình 2.6. Sơ đồ thiết kế test nhận diện đồ vật
Chỉ tiêu đánh giá:
Thời gian chuột khám phá vật thể được định nghĩa là khoảng thời gian tính từ lúc chuột bắt đầu hướng mũi về phía vật thể cách vật thể 2 cm, khám phá vật thể cho tới lúc chuột rời đi.
Chuột có tính tò mò, luôn có xu hướng khám phá không gian mới để thu thập thông tin mới của môi trường, qua đó bảo đảm sự an toàn cho bản thân động
vật. Do đó, nếu l-THP có tác dụng tăng cường, cải thiện trí nhớ, chuột sẽ có xu hướng kéo dài thời gian khám phá vật thể mới (O3) ở giai đoạn kiểm tra.
2.2.4. Đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase ex vivoNguyên tắc định lượng enzym AChE: Nguyên tắc định lượng enzym AChE:
Phép thử tác dụng ức chế enzym AChE bằng phương pháp đo quang dựa trên nguyên tắc của Ellman và cộng sự (1961): cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic. Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra acid 5-thio-2-nitrobenzoic (RS-) có màu vàng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm [30].
Động vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng đã được nghiên cứu trong 2 thí nghiệm trên.
Một ngày sau khi kết thúc test ORT, chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng sự [30].
Cách tiến hành thí nghiệm:
- Vỏ não chuột sau khi được tách trong điều kiện lạnh (hộp đá) sẽ được đặt ngay vào trong bình chứa nitơ lỏng để bảo quản tạm thời, sau đó cất trong tủ lạnh âm sâu (-800C) để bảo quản lâu dài cho đến khi tiến hành định lượng enzym AChE.
- Khi tiến hành định lượng, cân khối lượng mô (não) ở trên, thêm 10 lần thể tích dung dịch đệm phosphat có chứa 1% triton X-100, nghiền đồng nhất. Ly tâm với tốc độ 15.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Hút lấy dịch nổi và sử dụng như nguồn enzym. - Chuẩn bị hỗn hợp gồm: Nguồn enzym: DTNB 10 mM: ACCI 30 mM: Đệm phosphat, pH=8: 50 µl 20 µl 20 µl 160 µl
- Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm phosphat, pH = 8,0; dung dịch enzym vào từng giếng của đĩa 96 giếng. Hỗn hợp các dung dịch này được
trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. Sau đó dung dịch thuốc thử DTNB và dung
dịch cơ chất ACCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều, tiếp tục ủ hỗn ở
250C trong 15 phút.
- Lắc đều bằng máy lắc, đo ngay ở bước sóng 412 nm. Hoạt độ enzym AChE được tính toán dựa trên độ hấp thụ tại bước sóng 412 nm. Mỗi thử nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần được làm trên 3 giếng, mỗi giếng được máy tự động đo giá trị mật độ quang (OD) 10 lần. Giá trị tính toán là hoạt độ enzym AChE trong mô não chuột (đơn vị: nmol/phút/mg não chuột) và % giảm hoạt độ enzym AChE của các lô thử so với lô chứng bệnh lý.
- Công thức tính hoạt độ enzym AChE:
Hoạt độ AChE =OD x 1000 x 2
13600 x
1,5 x 32
100 x 1000 (nmol/phút/mg não chuột) Trong đó: OD là mật độ quang trung bình của các mẫu sau khi đã trừ đi mật độ quang của mẫu trắng
(Nguồn: Trường Đại học Toyama, Nhật Bản)
- Công thức tính % giảm hoạt độ enzym AChE so với lô chứng bệnh lý:
% giảm hoạt độ AChE so với nhóm bệnh lý=
=Hoạt độ AChE nhóm bệnh lý− Hoạt độ AChE nhóm thử
Hoạt độ AChE nhóm bệnh lý x100%
2.2.5. Đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro
Với mô hình in vitro, nguồn enzym AChE (Mã số: C3389, hoạt độ enzym: 200-1000 UI/mg protein) được mua sẵn của hãng Sigma. Đánh giá khả năng ức chế enzym AChE của l-THP và tacrin với nguyên tắc và phương pháp định lượng của Ellman tương tự như với mô hình ex vivo. Mỗi thử ngiệm được làm lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
- Công thức tính % hoạt tính bị ức chế của AChE trong mẫu thử:
I% = 1 − ODth ử
ODđối ch ứng x 100% Trong đó:
+ I%: phần trăm hoạt tính bị ức chế của AChE.
+ ODthử , ODđối chứng lần lượt là độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu đối chứng sau
khi đã trừ đi mật độ quang của mẫu trắng tương ứng.
Giá trị IC50 được tính toán dựa vào phần mềm GraphPad Prism phiên bản V5.01.
2.2.6. Liều lượng sử dụng trong nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, l-THP được sử dụng với mức liều 0,1 mg/kg và 0,3 mg/kg theo khối lượng cơ thể chuột. Đây là các mức liều có tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm, không có tác dụng an thần và không ảnh hưởng đến hoạt động tự nhiên của chuột[15], [16].
Liều của chất đối chiếu tacrin được chọn ở mức 2,5 mg/kg theo khối lượng cơ thể chuột. Đây là mức liều được Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương, Nguyễn Thị Phượng, Nguyễn Minh Khởi đã sử dụng thành công khi triển khai mô hình gây suy giảm khả năng học tập do thiếu máu não cục bộ tạm thời trên chuột nhắt trắng để đánh giá tác dụng cải thiện nhận thức [3].
Các thuốc thử được phân tán hoặc hòa tan trong Tween 80 1% để điều trị cho chuột.
2.3. Xử lý số liệu
Số liệu được lưu trữ bằng phần Excel 2007.
Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 20.0 và phần mềm GraphPad Prism phiên bản 5.01.
Kết quả được biểu diễn dưới dạng MEAN ± SE (giá trị trung bình ± sai số chuẩn).
Với phần mềm SPSS:
- Sử dụng kiểm định ANOVA với phương pháp đo lường lặp lại (repeated
measures), dùng hậu kiểm LSD để so sánh sự khác biệt về giá trị trung bình giữa
các lô.
- Sử dụng kiểm định One-Way ANOVA với hậu kiểm LSD nếu số liệu có phân phối chuẩn và sử dụng hậu kiểm Dunnette’s T3 nếu số liệu có phân phối không chuẩn để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình giữa các lô.
- Sử dụng Paired- Samples T Test để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình của thời gian khám phá 2 vật thể trong cùng 1 lô thí nghiệm.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Tác dụng cải thiện khả năng học tập và nghi nhớ in vivo bằng test mê lộ nƣớc Morris của l-tetrahydropalmatin nƣớc Morris của l-tetrahydropalmatin
3.1.1. Bài tập nhìn thấy bến đỗ
Thời gian tiềm tàng nhìn thấy bến đỗ của các lô chuột thí nghiệm ở bài tập nhìn thấy bến đỗ (thực hiện sau 2 ngày gây thiếu máu não cục bộ tạm thời) được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ở bài tập nhìn thấy bến đỗ
của các lô thí nghiệm
Nhận xét:
Trong bài tập nhìn thấy bến đỗ, sự khác biệt về thời gian tiềm tàng để tìm thấy bến đỗ giữa các lô thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê (p = 0,337).
3.1.2. Bài tập không nhìn thấy bến đỗ
Bài tập này được thực hiện trong 5 ngày (tiến hành từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7 sau khi gây thiếu máu não cục bộ tạm thời. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Sự thay đổi về thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ
ở bài tập không nhìn thấy bến đỗ của các lô thí nghiệm
(*p < 0,05; **p < 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý)
Nhận xét:
Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS 20.0, sử dụng kiểm định ANOVA với phương pháp đo lường lặp lại cho kết quả như sau:
+ Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ giữa các lô thí nghiệm (p = 0,022) nhưng không có sự tương tác giữa thời gian và các lô (p = 0,792).
Sử dụng hậu kiểm LSD để so sánh sự khác biệt giữa các lô, kết quả cụ thể như sau:
+ Thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của lô chứng sinh lý ngắn hơn rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý (p = 0,005). Kết quả này cho thấy chúng tôi đã áp dụng thành công mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng cách gây thiếu máu não cục bộ tạm thời theo mô hình thắt 2 động mạch cảnh kết hợp với rút máu đuôi chuột.
+ Khi so sánh các lô điều trị thuốc với lô chứng bệnh lý, lô chứng dương (điều trị bằng tacrin liều 2,5 mg/kg) và lô l-THP liều cao (0,3 mg/kg) có thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ ngắn hơn có ý nghĩa thống kê (với giá trị p lần lượt là 0,012 và 0,015). Trong khi đó, thời gian tiềm tàng tìm thấy bến đỗ của lô được điều trị bằng l-THP liều thấp (0,1 mg/kg) có xu hướng giảm so với lô chứng bệnh lý nhưng sự giảm này chưa đạt ý nghĩa thống kê (p = 0,341).
