1.3.2.1. Hệ vector nhị thể
Trờn cơ sở phỏt hiện vựng vir khụng cần nằm trờn cựng một plasmid với vựng T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xõm nhập của T-DNA vào hệ gen thực vật, người ta đó nghiờn cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể trong đú vựng T-DNA và vựng vir nằm trờn hai plasmid khỏc nhau nhưng trong cựng một chủng A. tumefaciens.
Hỡnh 1.4. Sơ đồ cấu trỳc vector nhị thể
Cú hai loại vector được sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ cú khả năng tự sao chộp và cú phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết cỏc gen khụng cần thiết giữa hai trỡnh tự biờn trỏi và biờn phải, gắn thờm một số thành phần tạo ra cấu trỳc mới gồm:
- Cỏc đơn vị sao chộp để DNA plasmid cú thể tự nhõn lờn trong cả E.
coli và Agrobacterium.
- Cỏc gen chọn lọc, gen chỉ thị.
- Vựng đa nhõn dũng nằm ở giữa hai trỡnh tự biờn trỏi và biờn phải để chốn gen mong muốn.
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vựng vir được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vựng T-DNA và biờn phải, biờn trỏi. Plasmid này được
cải tiến loại bỏ gen kớch thớch tế bào thực vật phỏt triển thành khối u, nhưng vẫn duy trỡ khả năng xõm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trỳc này cựng được đưa vào Agrobacterium, khi cỏc gen trờn vector bổ trợ hoạt động thỡ cỏc sản phẩm của nú sẽ tỏc động tới đoạn T-DNA trờn vector chuyển gen dẫn đến việc chuyển đoạn T-DNA sang tế bào thực vật.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chộp cú thể khụng bền vững trong E. coli khi cả hai vựng này cựng hoạt động. Tuy nhiờn, vector nhị thể cú một số ưu điểm như:
- Khụng xảy ra quỏ trỡnh tỏi tổ hợp giữa cỏc plasmid. - Kớch thước vector khỏ nhỏ.
Nhờ vậy, hiệu quả quỏ trỡnh chuyển gen từ E. coli sang A. tumefaciens đó tăng lờn. Hiện nay, vector nhị thể được sử dụng rộng rói với rất nhiều loại được thiết kế phự hợp với yờu cầu của quỏ trỡnh chuyển gen [6].
1.3.2.2. Hệ vector liờn hợp
Vector liờn hợp được xõy dựng trờn cơ sở sự tỏi tổ hợp giữa vựng tương đồng nằm trờn plasmid vi khuẩn (như vector của E. coli) với vựng T-DNA trờn Ti- plasmid của A. tumefaciens. Trong đú, người ta giữ lại vựng VIR, loại bỏ vựng mó hoỏ chức năng gõy khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid (hỡnh 1.5).
Cú 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liờn hợp:
(1) Ti-plasmid: cỏc gen gõy khối u đó bị thay bởi gen khỏng kanamycin của vi khuẩn.
(2) Vector trung gian: cú nguồn gốc từ pBR322 với kớch thước nhỏ và được sử dụng để bổ trợ chức năng khụng ưu việt của Ti-plasmid (kớch thước lớn và thiếu vựng MCS). Chỳng được nhõn lờn trong E. coli và chuyển sang A. tumefaciens nhờ quỏ trỡnh tiếp hợp. Do khụng thể sao chộp trong A. tumefaciens nờn chỳng mang những đoạn tương đồng với T-DNA.
(3) Vector trợ giỳp: tồn tại trong E. coli, cú kớch thước nhỏ, chứa cỏc gen di động (mob) và gen chuyển (tra) giỳp cho quỏ trỡnh tiếp hợp và chuyển vào A.
tumefaciens [48].
Hỡnh 1.5. Sơ đồ cấu trỳc vector liờn hợp