cao nhất, mức độ biểu hiện đậm vừa, vựng biểu hiện rộng. Ngoài ra, với cỏc mẫu lỏ và đoạn thõn sau khi được lõy nhiễm với Agrobacterium mật độ cao (OD600 >1,0) chỳng tụi quan sỏt thấy hiện tượng vi khuẩn sinh trưởng mạnh, lấn ỏt mẫu thực vật, làm mẫu thực vật khụng cú khả năng phục hồi sau khi biến nạp và việc loại bỏ Agrobacterium
gặp nhiều khú khăn. Vỡ thế, chỳng tụi đó lựa chọn mật độ vi khuẩn cú OD600 = 0,8 cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen tiếp theo.
3.2.4 Nghiờn cứu ảnh hưởng của hàm lượng Acetosyringone (AS) lờn tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus hiện tạm thời của gen gus
Acetosyringon (AS) là một hợp chất của phenol được tiết ra tại vựng bị thương của cõy. AS đúng vai trũ dẫn dụ vi khuẩn Agrobacterium tới mụ lõy nhiễm và kớch hoạt cỏc gen vựng vir hoạt động để hoạt húa cơ chế chuyển T-DNA vào tế bào thực vật.
AS được bổ sung vào dịch vi khuẩn 1 - 2h trước khi biến nạp với nồng độ lần lượt là: 0, 100, 200, 300 và 400 M. Kết quả thớ nghiệm được trỡnh bày ở bảng 3.16
3.16
mẫu khoai tõy sau khi chuyển gen
CT ( M) gus (%) Đ/c 0 6,67 7,78 1 50 21,66 26,66 2 100 26,11 31,11 3 200 31,66 32,78 4 400 8,33 9,44
Kết quả trờn bảng 3.16 cho thấy: AS cú ảnh hưởng rừ rệt tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus khoai tõy sau khi chuyển gen. Trong mụi trường khụng
cú AS, tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus mẫu khoai tõy gần như khụng đỏng kể. Biểu hiện tạm thời của gen gus tăng khi tăng nồng độ AS tới 200 uM.
Đối với mẫu lỏ: Tỷ lệ biểu hiện tạm thời đạt cao nhất là 31,66% khi bổ sung 200 M AS vào dịch vi khuẩn. Khi bổ sung nồng độ AS cao (400 M) lại làm giảm tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus là 8,33%.
Hỡnh 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus lờn mẫu lỏ khoai tõy
Tương tự với đoạn thõn: Tỷ lệ biểu hiện tạm thời đạt cao nhất là 32,78% khi bổ sung 200 M AS vào dịch vi khuẩn. Khi bổ sung nồng độ AS cao (400 M) lại làm giảm tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus cũn 9,44%.
Như vậy, với kết quả thu được ở nồng độ 200 M AS bổ sung vào dịch vi khuẩn từ 1 – 2 giờ trước khi biến nạp được chỳng tụi lựa chọn cho chuyển gen vào cõy khoai tõy.
Hỡnh 3.17. Ảnh hưởng của hàm lượng AS lờn tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở thõn khoai tõy
Thời gian lõy nhiễm ảnh hưởng rất lớn đến kết quả của quỏ trỡnh biến nạp. Nếu thời gian lõy nhiễm quỏ ngắn thỡ sẽ khụng đảm bảo hiệu quả xõm nhiễm của vi khuẩn vào mụ thực vật. Với mỗi đối tượng thực vật sẽ cú thời gian lõy nhiễm nhất định. Do đú trong thớ nghiệm này chỳng tụi nghiờn cứu thời gian lõy nhiễm ở cỏc thời gian khỏc nhau lần lượt là 20 phỳt, 40 phỳt và 60 phỳt. Kết quả thớ nghiệm được trỡnh bày ở bảng 3.17 Bảng 3.17. CT (phỳt) (%) (%) Đ/c 0 0 0 1 20 52,78 81,67 2 40 78,89 96,11 3 60 55,55 73,89
Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy: Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đối với mẫu lỏ biến nạp thấp nhất ở thời gian lõy nhiễm là 20 phỳt ( 52,78%). Tăng thời gian lõy nhiễm làm tăng hiệu quả biến nạp. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt cao nhất ở thời gian lõy nhiễm 40 phỳt chiếm 78,98%, mức độ biểu hiện màu xanh chàm đậm. Tuy nhiờn khi tăng thời gian lõy nhiễm lờn 60 phỳt thỡ lại giảm hiệu quả biến nạp xuống cũn 55,55%.
Đối với mẫu biến nạp là đoạn thõn: Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus thu được cao hơn so với mẫu lỏ biến nạp cụ thể ở cỏc cụng thức CT1, CT3 lần lượt cú tỷ lệ là 81,67%, 73,89% so với CT2 là 96,11% chứng tỏ rằng tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus cao nhất ở thời gian lõy nhiễm là 40 phỳt và ở đoạn thõn khả năng lõy nhiễm đạt cao hơn.
Hỡnh 3.18. Ảnh hưởng của thời gian lõy nhiễm lờn tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở đoạn thõn khoai tõy
Nguyờn nhõn của hiện tượng này cú thể là do thời gian lõy nhiễm cao sẽ tăng khả năng cạnh tranh giữa cỏc tế bào vi khuẩn làm ảnh hưởng tới hiệu quả của quỏ trỡnh biến nạp. Do đú chỳng tụi sử dụng thời gian lõy nhiễm là 40 phỳt cho cỏc thớ nghiệm chuyển gen tiếp theo trờn cõy khoai tõy Atlantic.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Dựa trờn cỏc kết quả nghiờn cứu thu được, chỳng tụi rỳt ra một số kết luận như sau:
a/ Nghiờn cứu xõy dựng hệ thống tỏi sinh:
- Mụi trường MS là mụi trường khoỏng cơ bản cho khả năng tạo callus từ mẫu lỏ và đoạn thõn tốt hơn, tốc độ hỡnh thành callus nhanh hơn, callus cú màu trắng, sỏng cú độ xốp hơn so với callus hỡnh thành trờn mụi trường N6.
- Mụi trường MS cú bổ sung 0,5-1 mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l IAA cho tỷ lệ tạo callus từ mẫu lỏ, đoạn thõn khoai tõy tốt nhất.
- BAP và kinetin cú ảnh hưởng tớch cực tới khả năng tạo callus từ mẫu lỏ và đoạn thõn khoai tõy. Mụi trường cú bổ sung 0,5 mg/l BAP và 1 mg/l kinetin cho tỉ lệ tạo callus cao nhất.
- Khả năng tạo callus từ mẫu lỏ hoặc đoạn thõn khoai tõy tụt nhất khi bổ sung 60 g/l xaccarozơ vào mụi trường nuụi cấy.
- Mụi trường cú bổ sung 400 mg/l casein hydrolysate đó cú tỏc dụng làm tăng khả năng tạo callus từ mẫu lỏ và đoạn thõn khoai tõy.
b/ Nghiờn cứu chuyển gen: một số yếu tố chớnh ảnh hưởng đến hiệu quả quỏ trỡnh chuyển gen vào cõy khoai tõy đó được tối ưu húa như sau:
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens: AGL-1 Vector chuyển gen: p6d-35SGUS Mật độ vi khuẩn lõy nhiễm: OD600 = 0,8
Nồng độ acetosyringone bổ sung vào dịch vi khuẩn lõy nhiễm và mụi trường đồng nuụi cấy: 200 àM.
Thời gian lõy nhiễm: 40 phỳt
2. Đề nghị
Cần tiếp tục cỏc nghiờn cứu hoàn thiện hệ thống tỏi sinh ở cõy khoai tõy nhằm tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nghiờn cứu chuyển gen
Tiếp tục cỏc nghiờn cứu cải thiện hiệu quả chuyển gen vào cõy khoai tõy thụng qua vi khuẩn Agrobacterium, trờn cơ sở đú tiến hành chuyển cỏc gen mang cỏc đặc tớnh cú giỏ trị vào cõy khoai tõy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt.
1.
(2003),
Nam, NXB Khoa .
2. Lờ Trần Bỡnh, Hồ Hữu Nhị, Lờ Thị Muội (1997), cụng nghệ sinh học thực vật
trong cải tiến giống cõy trồng, NXB Nụng nghiệp.
3. Lờ Trần Bỡnh, lờ Thị Muội (1999), Phõn lập gen và chọn dũng chống chịu ngoại
cảnh bất lợi ở cõy lỳa, NXB Đại học quốc gia, Hà nội.
4. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Cụng nghệ chuyển
gen động vật, thực vật, NXB Nụng nghiệp.
5. Trịnh Đỡnh Đạt (2006), Cụng nghệ di truyền, NXB Giỏo dục.
6. (2003),
.
7. Giỏp Thị Hoa (2008), Giỏo trỡnh cõy khoai tõy, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
8. Lờ Thị Ánh Hồng (2000), Cơ sở khoa học cụng nghệ chuyển gen ở thực vật, NXB Nụng nghiệp.
9. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Mai Xuõn Phỏn, Phan Xuõn Nguyờn, Đinh Văn Khiờm (2005), ”Nuụi cấy lắc và nuụi cấy Biụreactor trong nhõn
giống cõy hoa thu hải đường”, Tạp chớ CNSH (Số3), tr. 366-372.
10. Dương Tấn Nhựt (2010), Một số phương phỏp, hệ thống mới trong nghiờn cứu
cụng nghệ sinh học thực vật, NXB Nụng nghiệp TP. Hồ Chớ Minh.
11. Đinh Thị Phũng (2001),”Nghiờn cứu khả năng chịu hạn và chọn dũng chịu hạn
ở lỳa bằng cụng nghệ tế bào thực vật”, Luận ỏn tiến sĩ sinh học.
12. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuụi cấy mụ tế bào thực vật -Nghiờn cứu và ứng
dụng, NXB Nụng nghiệp, Hà nội .
14. Lờ Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền và chọn giống thực vật, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà nội.
15. Đinh Trường Sơn, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Quang Thạch (2009) ’’Xõy dựng hệ thống tỏi sinh in-vitro cõy khoai tõy phục vụ cho chọn tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển
gen và dung hợp tế bào trần” Tạp chớ khoa học và phỏt triển, Tập 7 (số 4), 533-
542.
16. (2005), .
17. Đỗ Năng Vịnh (2008), Cụng nghệ sinh học đại cương, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
18. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giỏo dục.
19. Vũ Văn Vụ (2005), Cụng nghệ sinh thực vật, NXB Giỏo dục.
Tài liệu tiếng anh.
20. Bouche, F.B.; Marquet-Blouin, E.; Yanagi, Y.; Steinmetz, A.; Muller, C.P. (2003) Neutralizing immunogenicity of a polyepitope antigen expressed in a transgenic food plant: a novel antigen to protect against measles. Vaccine 21, 2074- 2081.
21. Beaujean A., Sangwan1 R.S, Lecardonnel A, Sangwan-Norreel B.S. (1998),
“Agrobacterium-mediated transformation of three economically important
potato cultivars using sliced internodal explants: an efficient protocol of transformation”, Journal of Experimental Botany, 49 (326), pp. 1589- 1595.
22. Cheng M., Lowe B. A., Michael S. T., Ye X. X., Armstrong C. L. (2004), “Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species”, In Vitro Cel. & Dev. Bio-Plant,40 (1), pp. 31-45.
23. Chu CC., Wang CC., Sun CS., Hsu C.,Yin KC., Chu CY., Bi FY. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen source. Sci Sin 18: 659-668.
24. De la Pena A., Lorz H., Schell J. (1987), “Transgenic rice plants obtained by injecting DNA into young floral tillers”, Nature, 325, pp. 274-276.
25. Edelman M. (1999), Transgenic lemnaceae, International application published under the patent cooperation treaty (PTC), WO 99/19498
26. Frame B. R., Shou H., Chikwamba R. K., Zhang Z. I., Xiang C. I., Fonger T. M., Pegg S. E. K., Li B., Nettleton D. S., Pei D., Wang K. (2002),
“Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryos using a
standard binary vector system” Plant Physiol., 129, pp. 13-22.
27. Gelvin S. B. (2003), “Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology reviews, 2003(3), pp. 16-37.
28. Gonzal G.R., Sanchez M.S.D., Guerra Z.Z., Campos M.J., Quesada L.A., ValdiviaM.R. (2008), "Efficient regenation and Agrobacterium tumefaciens
mediated transformation of recalcitrant sweet potato ( Ipomoea batatas L) cultivars", Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 16 (2), pp. 25- 33.
29. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994), "Effcient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA", Plant Journal, 6(2), pp. 271-282.
30. Hooykaas P. J. J., Schilperoort R. A. (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Mol. Biol., 19, pp. 15 -38.
31. Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., Kumashiro T. (1996), “High efficiency transformation of Maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium
tumefaciens”, Nature Biotechnology, 14, pp. 745-750.
32. Kapusta, J.; Modelska, A.; Figlarowicz, M.; Pniewski, T.; Letellier, M.; Lisowa, O.; Yusibov, V.; Kopowski, H.; Plucienniczak, A.; Legocki, A. B. (1999) A plant- derived edible vaccine against hepatitis B virus. FASEB Journal 13, 1796-1799.
33. Kehm, R.; Jakob, N.J.; Welzel, T.M.; Tobiasch, E.; Viczian, O.; Jock, S.; Geider, K.; Sule, S.; Darai, G. (2001) Expression of immunogenic puumala virus
nucleocapsid protein in transgenic tobacco and potato plants. Virus Genes 22, 73-83.
34. Kong, Q.; Richter, L.; Yang, Y.F.; Arntzen, C.J.; Mason, H.S.; Thanavala, Y. (2001) Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 98, 11539-11544.
35. Mason, H.S.; Ball, J.M.; Shi, J.J.; Jiang, X.; Estes, M.K.; Arntzen, C.J. (1996) Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 93, 5335-5340.
36. Marchant & Dix (1986), The torque due to the liquid on a spinning disc atomizer.Journal of Agricultural Engineering Research,33: pp. 273-280.
37. Mason, H.S.; Ball, J.M.; Shi, J.J.; Jiang, X.; Estes, M.K.; Arntzen, C.J. (1996) Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 93, 5335-5340.
38. Mclean B. G., Greene E. A., Zambryski P. C. (1994), “Mutants of
Agrobacterium VirA that active vir gene expression in the absence of the
inducer acetosyringone”, The Journal of Biol. Chemis., 269(4), pp. 2645-2651.
39. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.;
40. Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wenck A. R. G. (2000), “The use of phoSPhomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Rep., 19, pp. 798-803.
41. Sandhu, J.S.; Krasnyanski, S.F.; Domier, L.L.; Korban, S.S.; Osadjan, M.D.; Buetow, D.E. (2000) Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response. Transgenic Research 9, 127-135.
42. Sanford J. C., Klein T. M., Wolf E. D., Allen N. (1987), “Delivery of substances into cells and tissues using a microprojectile bombardment process”, J. Particle
Sci. Technol., 5, pp. 27–37.
43. Sato N., Enriquez A.G., Ferreira A. (2007), "Efficient transformation of potato stem segment from cultivar Desiree, using phosphinothricin as selection marker", Biotechnology Aplicada, 24, pp. 139- 144
44. Sharma K. K., Bhatnagar-Mathur P., Thorpe T. A., (2005), “Genetic transformation technology: status and problems”, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant,41, pp. 102–112.
45. Tackaberry, E.S.; Dudani, A.K.; Prior, F.; Tocchi, M.; Sardana, R.; Altosaar, I.; Ganz, P.R. (1999) Development of biopharmaceuticals in plant expression systems: cloning, expression and immunological reactivity of human cytomegalovirus glycoprotein B (UL55) in seeds of transgenic tobacco. Vaccine
17, 3020-3029.
46. Trojanowska M. R. (2002), “Alternative methods of plant transformation – a shot review”, Cellular & Molecular Biology Letter, 7, pp. 849 – 858
47. Warzecha, H.; Mason, H.S.; lane,C.; Tryggvesson, A.; Rybicki, E.; Williamson, A.L.; Clements, J.D.; Rose, R.C. (2003) Oral immunogenicity of human papillomavirus- like particles expressed in potato. Journal of Virology 77, 8702- 8711.
48. Walkerpeach C. R., Velten J. (1994), “Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: cointergrate and binary vector systems”, Plant Mol. Biol. Manual B1, pp. 1-19.
49. Wie & CS (2000), “Agrobacterium-mediated transformation: status and prospect”, Chinese Sci. Bulletin, 45(17), pp. 1537-1546.Zupan J., Muth T. R., Draper O., Zambryski P. (2000), “The transfer of DNA from A. tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights”, Plant J., 23, pp. 11-28.
50. Zupan J., Muth T. R., Draper O., Zambryski P. (2000), “The transfer of DNA from A. tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights”, Plant J., 23, pp. 11-28.
Tài liệu khỏc
51. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/LB%20media.htm
52. http://thuviensinhhoc.com/FlashPaper/Cong_nghe_sinh_hoc/chuong7.swf
53. http://www.cuctrongtrot.gov.vn/Tech_Science.aspx?index=detail&type=a&idtin=208
Phụ lục1: Thành phần mụi trƣờng MS (Murashige and Skoogs, 1972) Thành phần mụi trƣờng Tờn hoỏ chất Nồng độ (mg/l) Đa lƣợng NH4NO3 1650 KNO3 1900 MgSO4. 7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2. 2H2O 440 Vi lƣợng H3BO3 6,2 MnSO4. 4H2O 17,0 ZnSO4. 7H2O 10,5 KI 0,83 CuSO4. 5H2O 0,025 MoO4Na2. 2H2O 0,25 CoCl2. 6H2O 0,025 Sắt FeSO4. 7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Chất hữu cơ và Vitamin Axit Nicotinic (B5) 0,5 Thiamin HCl 1 Myo-Inositol 100 Pyrodoxin 0,5 Đường 60 Thạch 8
Phụ lục 2: Thành phần mụi trƣờng N6 (Chu và cộng sự, 1975) Thành phần mụi trƣờng Tờn hoỏ chất Nồng độ (mg/l) Đa lƣợng (NH4 )2SO4 463,00 KNO3 2830,00 MgSO4 90,27 KH2PO4 400,00 CaCl2 125,33 Vi lƣợng H3BO3 0,80 MnSO4. H2O 3,33 ZnSO4. 7H2O 1,50 KI 0,80 Sắt Fe NaEDTA 36,70 Chất hữu cơ và Vitamin Axit Nicotinic (B5) 0,50 Thiamin HCl 1,00 Glyxin 2,00 Pyrodoxin HCL 0,50 Đường 60 Thạch 8 Thành phần mụi trƣờng LB Yeast extract 5g Typtone( or peptone) 10g NaCl 8g H20 900ml pH 7.2
Phụ lục 3: Mụi trƣờng nuụi cấy sử dụng trong nghiờn cứu
NC = MS + 60-80 g/l xaccarozơ + 100 mg/l myoinositol + 8 g/l agar
CI = MS + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/l myoinositol + 8 g/l agar
LCM= MS + 30g/l xaccarozơ + 100 mg/l myoinositol + 8 g/l agar + 1 mg/l 2,4-D + 500 mg/l Casein Hydrolysate(CH)
AM1 = CI + 1 mg/l 2,4-D + 0,1 mg/l IAA
AM2= CI + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,1 mg/l IAA
BKM1 = CI + 1 mg/l 2,4-D + 0,1 mg/l IAA+ 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l kinetin
BKM2= CI + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,1 mg/l IAA+ 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l kinetin