giống lúa bằng PCR
để phát hiện gen kháng bệnh bạc lá, ựạo ôn, rầy nâu các dòng G2 của 4 giống lúa bằng PCR chúng tôi tiến hành chiết tách DNA của các dòng G2 riêng biệt của từng giống theo theo quy trình của Zheng và cộng sự (1995).
* Các bước tiến hành:
+ 2 cm mẫu lá non thu vào buổi sáng ựược cắt nhỏ vào cối nghiền với 400ộl dung dịch chiết cho tới khi thành dịch màu xanh lá cây. Bổ sung 400ộl dung dịch chiết vào cối rồi chuyển sang ống eppondorf.
+ Thêm 400ộl dung dịch Chloroform : Phenol : Isoamyalcohol (25:24:1), ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C, hút dịch ựồng nhất phắa trên.
+ Cho thêm vào ựó 400ộl Phenol : Isoamyalcohol (24:1), ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C.
+ Thu dịch trên và tủa DNA bằng 800ộl ethanol 99,9%, ly tâm 5 phút, 13000 vòng/phút, 40C.
+ Phần DNA kết tủa dưới ựáy ống ựược giữ lại, rửa tủa bằng ethanol 70% và ựể khô tự nhiên bằng cách úp ngược ống nghiệm trên giấy thấm. Hòa tủa trong 50ộl ựệm TE.
+ Bảo quản ở 4oC và sử dụng dần.
* Kiểm tra ựộ tinh sạch và nồng ựộ của DNA bằng cách ựiện di trên gel agarose 1 %: Chuẩn bị gel như sau: cân 0,5 g agarose, bổ sung TAE 1x sao cho xấp xỉ 50ml ựể sau khi ựun sôi thu ựược thể tắch là 50 ml, ựun sôi trong lò vi sóng tới khi nào tạo thành một dung dịch ựồng nhất, ựể nguội khoảng 50 Ờ 600C rồi ựổ vào khuôn sao cho không ựể lại bọt khắ. để gel ựông lại trong khoảng 30 phút, sau ựó tháo lược ra và ựổ ựệm TAE 1x ngập khoảng 4mm, load mẫu vào giếng rồi tiến hành ựiện di ở hiệu ựiện thế 60V, cường ựộ 120 mA trong thời gian 15 phút. Sau ựiện di, ngâm lắc bản gel trong dung dịch Ethydium bromide 5% trong 10 phút, soi gel và chụp ảnh tại máy UV. Nếu thấy các băng DNA thu ựược gọn và sáng chứng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 34 tỏ rằng DNA tổng số thu ựược ắt bị ựứt gãy, nồng ựộ DNA cao ựủ tiêu chuẩn.
Bảng 3.1. Thành phần dung dịch chiết tách Thành phần Nồng ựộ dd mẹ Nồng ựộ dd làm việc Hỗn hợp 50ml dd chiết tách Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2.5ml EDTA pH=8 0.5M 0.25mM 2.5ml NaCl 5M 300mM 3.0ml SDS 10% 1% 5.0ml H2O 37.0ml Bảng 3.2. Thành phần dung dịch TE Thành phần Nồng ựộ dd mẹ Nồng ựộ dd làm việc Thể tắch 50ml Tris-HCl 1M 10mM 0.5ml EDTA 0.5M 1mM 0.1ml H2O 49.4ml
3.2.3.1. Kiểm tra khả năng mang gen Xa4, Xa7 kháng bệnh bạc lá của 4 giống lúa bằng phương pháp PCR
+ Phản ứng PCR
Bảng 3.3. Trình tự các mồi dùng ựể phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 Chỉ thị Gen liên kết Trình tự mồi Khoảng cách cM Tài liệu tham khảo Npb181 Xa4 F: 5Ỗ-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3Ỗ R: 5Ỗ-GTGCTATAAAAGGCATTCGGG-3Ỗ 1.7 Yoshimura và cs.,1992
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 35 R:5ỖCATCACGGTCACCGCCATATCGGA3Ỗ 2.5 cs., 2004
Phản ứng PCR cho việc xác ựịnh 2 gen Xa4 và Xa7 với thể tắch 25 ộl gồm: 12,5 ộl PCR master mix 2X, 1 ộl mỗi mồi, 1 ộl DNA và 9,5 ộl nước. Chu kì nhiệt của phản ứng gồm: 950C trong 3 phút, tiếp theo là 29 chu kì, với mỗi chu kì có các bước: 950C-30 giây, 500C-30 giây, 720C - 30 giây, sau ựó giữ ở 720C trong 7 phút.
- điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% ở 65V. Bản gel ựược nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.
3.2.3.2. Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh ựạo ôn Pi-ta của 4 giống lúa bằng PCR
- Mồi và trình tự mồi của phản ứng PCR (Jia et al., 2002): YL155: 5′-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3′ YL 87: 5′-CTA- CCAACAAGTTCATCAAA-3′
- Thành phần dung dịch phản ứng PCR với thể tắch 25 ộl gồm: 12,5 ộl PCR master mix 2X, 1 ộl mỗi mồi, 1 ộl DNA và 9,5 ộl nước.
- Chu kì nhiệt của phản ứng: 950C- 3 phút, tiếp theo là 29 chu kì, với mỗi chu kì có các bước: 950C-30 giây, 500C-30 giây, 720C - 30 giây, sau ựó giữ ở 720C trong 7 phút.
- điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% ở 65V. Bản gel ựược nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.
3.2.3.3. Kiểm tra khả năng mang gen Bph4, Bph10 kháng rầy nâu của 4 giống lúa bằng PCR
- Phản ứng PCR
Bảng 3.4. Trình tự các mồi dùng ựể phát hiện gen kháng rầy nâu Bph4, Bph10
Chỉ thị Trình tự mồi Gen kháng Liên kết Tham khảo RG 457FL/RL F:5'GCAGTGGCAGATGGGATCGT-3Ỗ, R:5'GCTCCGAAATCCCAAGCGAT- 3' Bph10 1,7cM Lang và cs., 1999
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 36 RM119 F 5ỖCAT CCC CCT GCT GCT GCT GCT G - 3Ỗ
R:5ỖCGC CGG ATG TGT GGG ACTAGC G - 3Ỗ
Bph4 Lưu Thị Ngọc
Huyền (2003)
- Chu trình làm việc của máy PCR
đối với mồi RG 457FL/RL
Chu kì nhiệt của phản ứng: 940C- 5 phút, tiếp theo là 30 chu kì, với mỗi chu kì có các bước: 940C-30 giây, 550C-30 giây, 720C Ờ 1 phút , sau ựó giữ ở 720C trong 5 phút.
đối với mồi RM119
Chu kì nhiệt của phản ứng: 940C- 2 phút, tiếp theo là 30 chu kì, với mỗi chu kì có các bước: 940C-45 giây, 560C-30 giây, 720C Ờ 45 giây , sau ựó giữ ở 720C trong 7 phút.
- điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% ở 65V. Bản gel ựược nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.