2.3.2.1. Cơ sở của tắnh kháng bệnh ựạo ôn
Bệnh ựạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong những bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng tại hầu hết các vùng trồng lúa trên thế giới. Bệnh làm lá lúa bị cháy, bông bạc nên ảnh hưởng rất lớn tới năng suất. Từ nhiều thế kỷ trước bệnh ựã ựược quan sát thấy ở các nước châu Á như Nhật Bản, Ấn độ, Trung Quốc, các nước vùng Trung Á, Tây Á; ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, quần ựảo Antin; ở châu Âu: Ý, Bungari, Rummani, Bồ đào Nha, Liên Xô, Ầđến những năm 1560 bệnh ựã ựược phát hiện chắnh thức ở Ý (Lê Lương Tề, 1988). Sau ựó bệnh ựược phát hiện ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906, Ấn độ năm 1913. Cho ựến nay bệnh ựạo ôn ựã ựược ghi nhận có mặt và gây hại ở trên 85 quốc gia trên thế giới bao gồm Châu Á, Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Phi Ầ
Ở Việt Nam, bệnh ựạo ôn ựã ựược biết ựến từ lâu với tên gọi là bệnh Ộtiêm lụiỢ, bệnh Ộcháy lá lúaỢ. Năm 1921, Fivincens ựã thấy bệnh xuất hiện trên lúa ở các tỉnh phắa Nam. Sau ựó ựến năm 1951, Roger cũng ựã thấy bệnh xuất hiện ở các tỉnh phắa Bắc. Nhưng thời kỳ ựó bệnh ắt phổ biến, gây hại nhẹ nên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 17 không ựược chú ý nghiên cứu. Năm 1956, người ta phát hiện thấy ở một trong những khu vực trồng lúa của nông trường đồng Giao bệnh ựạo ôn bột phát làm chết lụi 200 ha lúa. Sau ựó bệnh cũng ựã gây hại nghiêm trọng ở Hải Hưng, Hà Sơn Bình, Thái Bình, Hà Nội, Hải Phòng và nhiều khu vực khác. Có thể nói những năm 1956 ựến 1962 là thời kỳ bệnh ựạo ôn phát sinh thành dịch ở miền Bắc nước ta. Tiếp theo ựó từ năm 1972, nhất là từ năm 1976 ựến nay bệnh ựạo ôn ựã gây thành dịch hại ở nhiều vùng trọng ựiểm thâm canh lúa thuộc ựồng bằng sông Hồng, ựồng bằng sông Cửu Long, các tỉnh duyên hải miền Trung và cả Tây nguyên, một số vùng trung du miền núi phắa Bắc trên các giống lúa NN8, IR 1561-1-2; nếp cái hoa vàng...
Những nghiên cứu miễn dịch học ựã chỉ ra rằng lúa có hai hệ thống miễn dịch bẩm sinh, có thể bảo vệ chúng trước sự tấn công của nhiều nguồn bệnh khác nhau. Các receptor trên màng phát hiện ra tắnh chất không chuyên biệt của chủng gây bệnh ựược gọi là PAMPs (pathogen associated molecular pattern). Hệ thống miễn dịch ựầu tiên ựược kắch hoạt là PTI (PAMP - triggered immunity). Trong phản ứng này nguồn bệnh có nhiều phân tử ỘeffectorỢ nhằm tránh né hệ thống miễn dịch PTI. Nếu một nguồn bệnh tránh né ựược hệ thống bảo vệ thứ nhất, nó phải vượt qua hệ thống bảo vệ thứ hai ựể gây bệnh cho lúa. Hệ thống tự bảo vệ thứ hai ựược gọi là ETI (effector triggered immunity: miễn dịch nhờ kắch hoạt effector). ETI bị kắch hoạt bởi các protein của gen kháng bệnh (R). Chúng hoạt ựộng như những receptor trong tế bào, ghi nhận trực tiếp hoặc gián tiếp các effector của nguồn bệnh. Người ta gọi các effector của nguồn bệnh là protein không chứa ựộc tắnh (Avr proteins), mã hoá cho các protein này là các gen Avr tương ứng (gen không ựộc) (Chisholm và cs., 2006).
Khả năng kháng bệnh ựạo ôn của lúa do các gen kháng chịu trách nhiệm, và ựược ựặt tên theo tên nấm Pyricularia (Pi). Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới ựã xác ựịnh ựược 96 gen kháng ựạo ôn chắnh (Yu và cs., 2002). Ngoài ra, việc giải mã xong trình tự gen cây lúa năm 2002 ựã mở ra nhiều triển vọng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 18 cho việc ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo các giống lúa kháng bệnh ựạo ôn (Yu và cs., 2002).
Cở sở di truyền tắnh kháng ựạo ôn ựã ựược nghiên cứu rộng rãi từ rất lâu. Năm 1967, IRRI ựã thiết lập một hệ thống phân biệt các chủng sinh lý race/pathotype của nấm dựa trên một bộ giống chỉ thị (8 giống) theo thứ tự là: Raminad, Zenith, Np-125, Usen, Dular, Kanto 51, Sha-tiao-tsao, Caloro. Tuy nhiên, bộ giống chỉ thị này chứa ắt gen kháng (5 gen) nên không thể ựánh giá ựược ựúng mức ựộ ựa dạng của quần thể nấm. Hiện nay, ở các quốc gia khác nhau ựã phát triển bộ giống chỉ thị riêng sử dụng các dòng ựẳng gen (Near Isogenic Lines - NILs) chứa một hoặc một vài gen kháng. Gần ựây với sự trợ giúp của kỹ thuật sinh học phân tử (RFLP, AFLP, CAP, RGA, SSR,Ầ) các nhà khoa học ựã xác ựịnh ựược khoảng 40 gen kháng chắnh (Sallaud và cs., 2003). Các gen kháng này ựược qui tụ vào các dòng/giống lúa khác nhau phát triển các dòng/giống lúa kháng. Tuy nhiên, tắnh kháng ựơn gen thường chỉ kháng trong giới hạn các chủng ựịa lý nhất ựịnh và thường bị mất hiệu lực sau trồng một thời gian (thường từ 1 - 5 năm), bởi sự xuất hiện của chủng mới trong phân bố vùng ựịa lý ựó.
2.3.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh ựạo ôn
a, Chỉ thị RAPD và SCAR
RAPD là một kỹ thuật ựược sử dụng rộng rãi ựể xác ựịnh các chỉ thị liên kết với gen kháng ựạo ôn. Naweed và cs (1995) sử dụng kỹ thuật RAPD với 468 mồi ngẫu nhiên ựã xác ựịnh ựược 2 chỉ thị liên kết với gen Pi - 10t ở giống lúa Tongil (Naweed và cs., 1995).
Sandhu và cs (2003) ựã sử dụng 7 mồi RAPD ựể phân tắch ựa hình giữa các dòng kháng và dòng nhiễm ựạo ôn của 3 giống lúa trồng ở Braxin. Kết quả ựã chỉ ra sự khác biệt rõ ràng giữa các dòng kháng và dòng nhiễm, 9 băng ADN
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 19 khuếch ựại bởi 7 mồi ựã ựược xác ựịnh như các chỉ thị trội cho chọn các dòng lúa kháng ựạo ôn (Sandhu và cs., 2003).
SCAR là một loại chỉ thị phát triển từ chỉ thị RAPD, ựược sử dụng cho chọn giống kháng ựạo ôn. Các chỉ thị SCAR ưu ựiểm hơn so với chỉ thị RAPD bởi chúng ắt bị ảnh hưởng bởi các ựiều kiện phản ứng, mức ựộ lặp lại cao, tiến hành nhanh và cho các sản phẩm ựặc hiệu. Năm 2005, Sobir và cs ựã sử dụng 2 chỉ thị SCAR ựể xác ựịnh sự có mặt của gen kháng Pi-b và Pi-ta trên 28 kiểu gen ở lúa (gồm 22 dạng trồng trọt và 6 dạng hoang dại). Kết quả phân tắch chỉ ra, 15 kiểu mang cả hai gen trong ựó có Oryza rufipogon, 6 kiểu mang gen Pi-b trong ựó có Oryza glumaepatula, Oryza officialis, Oryza Latifolia và Oryza malapuzhaensis (Sobir và cs., 2005).
b) Chỉ thị STS
Chỉ thị STS ựược phát triển từ các chỉ thị RFLP và AFLP, nó cho phép xác ựịnh những vị trắ ựánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit biết trước của các ADN chỉ thị. Ở lúa, các STS ựược coi như các mốc chuẩn, nhờ vậy việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan ựến tắnh kháng ựạo ôn ựược tiến hành một cách dễ dàng. Qua phân tắch di truyền trên quần thể con lai F3 của cặp lai C101LAC (giống cho gen kháng Pi-1) và CO39 (giống dễ mắc bệnh ựạo ôn) bằng kỹ thuật RFLP. Wu và cộng sự (2004) ựã thiết kế ựược một cặp mồi STS cho chọn lọc các dòng lúa mang gen kháng Pi-1 (Wu và cs., 2004). Năm 2008, Masahiro và cộng sự cũng ựã phát triển ựược một chỉ thị STS sử dụng cho chọn các dòng lúa mang gen kháng Pi-b trong bảy giống lúa nội ựịa của Hàn Quốc (Masahiro và cs., 2008).
c) Chỉ thị SSR
đối với các nghiên cứu về bệnh lúa, SSR là một trong những kỹ thuật di truyền ựược xem là rất thắch hợp trong việc lập bản ựồ liên kết di truyền, phân tắch ựa dạng và trong các chương trình chọn giống kháng ựạo ôn. Năm 2004 Fjellstrom và cộng sự phân tắch trình tự genom gần locus Pi-z của dạng lúa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 20 Nipponbare, ựã phát hiện một số lượng lớn các ựoạn SSR có thể sử dụng làm chỉ thị. Ba chỉ thị SSR gồm AP5659-1, AP5659-3 và AP5659-5 liên kết rất chặt với locus Pi-z ựã ựược phát triển ựể chọn giống lúa mang gen kháng Pi-z (Fjellstrom và cs., 2004).
Năm 2008 Wei Li và Cs ựã phân lập 160 chủng Magnaporthe oryzae
(trước ựây là Magnaporthe grisea) và xác ựịnh ựược Gen Pi20(t) có phổ kháng ựạo ôn rộng ở Trung Quốc, trong ựó, chủng 98095 có thể phân biệt sự có mặt của gen Pi20(t) trong cv.IR24. Ba marker SSR ựược sử dụng ựể nhận biết gen Pi20(t) ựược nằm gần vùng tâm ựộng của nhiễm sắc thể 12 và cũng nhận ra 526 dòng dễ bị ảnh hưởng ở thế hệ F2 mà có nguồn gốc từ việc lai giữa giống Asominori (một giống rất nhạy cảm) với giống kháng IR24. Marker SSR OSR32 ựã lập bản ựồ ở khoảng cách 0,2 cM từ Pi20(t), và Marker SSR RM28050 ựã lập bản ựồ từ sườn khác của Pi20(t) ở khoảng cách 0,4 cM. Ba marker SSR khác là RM1337, RM5364 và RM7102, ựồng phân biệt Pi20(t). Như vậy, ựây là một trong những phương pháp hữu ắch trong chương trình chọn giống dựa vào dấu chuẩn marker ựể ựưa Pi20(t) vào những dòng lúa chất lượng và ựưa chủng kháng bền, rộng vào Magnaporthe oryzae (Wei và cs., 2008)
Năm 2009, Kei Matsushita và Cs ựã nghiên cứu khả năng kháng bệnh ựạo ôn của giống lúa Chumroo, ựây là giống lúa thường ựược trồng ở các vùng cao của Bhutan, Nhật Bản. Trong hơn 20 năm qua, giống lúa này ựược xem là kháng bền với ựạo ôn và chưa có bằng chứng nào chứng tỏ chúng bị nhiễm. Chumroo ựã ựược lây nhiễm với 22 chủng ựạo ôn ựược chọn lọc theo tiêu chuẩn về các chủng khác nhau của Nhật Bản. Kết quả cho thấy, giống lúa Chumroo có khả năng kháng tất cả các chủng này. để xác ựịnh các gen kháng, Chumroo ựược lai với giống lúa Koshihikari dễ bị nhiễm bệnh, các cây thu ựược ở thế hệ F1 có khả năng kháng bệnh. Phân tắch sự khác biệt của 300 dòng bố mẹ F3 cho thấy sự khác biệt theo tỷ lệ 1:2:1 và chỉ ra rằng một gen ựơn trội kiểm soát tắnh kháng ựạo ôn với chủng Ao 92-06-2. Các locus của Chumroo (Pi46 (t)) ựược lập bản
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 21 ựồ giữa hai marker SSR là RM6748 và RM5473, nằm ở phần cuối của cánh tay dài nhiễm sắc thể số 4, sử dụng phân tắch liên kết với các marker SSR. Marker gần nhất RM5473 ựã liên kết với locus kháng giả ựịnh ở khoảng cách bản ựồ là 3,2 cM. Trên nhiễm sắc thể, không xác ựịnh ựược gen nào kháng hoàn toàn, trong khi ựó, lại có mặt 2 gen kháng một phần là Pi39(t) và Pikahei-1(t) ựược ựặt trên phần cuối của nhiễm sắc thể số 4 và liên kết chặt chẽ với RM5473 [41]. Vì vậy, Kei Matsushita và Cs ựã thiết kết Pi46(t) như là một locus lạ kháng ựạo ôn (Kei và cs., 2011).
Lã Tuấn Nghĩa và cs (2009) ựã lây nhiễm nhân tạo ựể xác ựịnh các gen kháng hiệu quả qua sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo với bộ giống chỉ thị do IRRI cung cấp và các dòng lúa thuần của Việt Nam, cho thấy hai gen Pi-1
và Pi-5 kháng tốt nhất với các nòi nấm ở những vùng sinh thái nông nghiệp miền Bắc, tỷ lệ kháng với các nòi nấm ựều rất cao (Pi-1 là 82%; Pi-5 là 78%). Các gen kháng nói trên sẽ ựược sử dụng ựể qui tụ vào giống/dòng lúa ựể cải tạo tắnh kháng (Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2009).