Tất cả những thiết bị tạo mảng đều có 3 thành phần cơ bản [30]: (1) một vị trí chứa mẫu để tạo mảng, thường sử dụng những đĩa 384 giếng, (2) một dụng cụ để in mẫu, và (3) điểm đến của mẫu, thường là những tấm 1 × 3 inch (25 × 75 mm). Có 2 loại robot tạo mảng cơ bản, một loại sử dụng những kim in hay in tiếp xúc, và một loại sử dụng in áp điện không tiếp xúc. In không tiếp xúc thì phân phối một loại mẫu nhanh hơn nhưng thay đổi giữa các mẫu thì chậm hơn so với in tiếp xúc. Những thiết bị in áp điện có sẵn hiện nay có xu hướng làm nhiễm giữa các chấm, những đầu tip của nó thì mảnh khảnh và rất đắt để thay thế. In tiếp xúc có lợi thế chính là cung cấp những chấm protein chất lượng cao. Kim in tiếp xúc có thể là những kim in đầu đặc hay đầu có rãnh. Kim in đầu đặc cần được nhúng vào mẫu giữa mỗi lần tạo chấm. Kim in có rãnh giữ được một thể tích mẫu lớn bởi cơ cấu mao quản, do đó phân phối một thể tích xác định mỗi lần tiếp xúc với bản in. Điều này tránh được sự lấy mẫu lặp lại sau mỗi lần in và làm cho việc tạo chấm của cùng một loại protein nhanh hơn. Tuy nhiên, kim in đầu đặc có lợi thế là rẻ hơn, khỏe hơn và không bị ngẽn. Một chi tiết liên quan đến viêc tạo mảng protein với kim in đầu có rãnh là sự thay đổi độ nhớt vốn có giữa các mẫu protein ảnh hưởng đến thể tích phân phối mỗi protein. Những kim in có sẵn có đường kính trong phạm vi 75 đến 300 µm [30].
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Lý tưởng nhất, số phân tử bắt giữ cho một protein mục tiêu nào đó phải đủ nhỏ để quá trình bắt giữ không làm thay đổi nồng độ của phân tử đích trong mẫu. Vì vậy, đối với số phân tử bắt giữ không đổi, một kích thước điểm nhỏ hơn sẽ cho ra một mật độ cao hơn và cường độ tín hiệu mạnh hơn. Tuy nhiên, nếu vượt quá sức chứa của bề mặt mảng, dần dần những điểm kích thước nhỏ hơn sẽ có cường độ tổng số thấp hơn và độ nhạy sẽ bị mất. Trong thực tế, nồng độ tối ưu của phân tử bắt giữ và đích cần được xác định bằng thực nghiệm [30].
Khi làm thí nghiệm về microarray, nên bắt đầu bằng một chuỗi pha loãng của mẫu protein/kháng thể được cố định, trong phạm vi từ 1 - 500 µg/mL nếu nồng độ được biết. Theo kinh nghiệm, những điểm 150µm sẽ sử dụng 0,5 ” 1 nL, 250µm sẽ sử dụng 2 ” 5nL, và 400µm sẽ sử dụng 10 ” 20 nL. Trong thí nghiệm này, lý tưởng nhất là protein nên được đánh dấu để cho phép quan sát và đo lường trực tiếp. Số điểm sẽ phụ thuộc đáng kể vào trạng thái bề mặt và thành phần đệm. Để nâng cao độ chính xác của kết quả, tất cả những điểm nên được lặp lại ít nhất bốn lần, và tốt nhất lặp lại vài lần trên bề mặt tấm để loại trừ các biến thể cục bộ. Trong hầu hết các trường hợp phát hiện đơn giản, mục đích ở đây sẽ là thiết lập nồng độ tối thiểu của tác nhân bắt giữ cần để bão hòa bề mặt slide.
Phải tối ưu điều kiện tạo mảng protein vì 3 lý do quan trọng: (1) duy trì điều kiện không biến tính, đặc biệt với những mảng chức năng, (2) giảm thiểu những tương tác không đặc hiệu và (3) tạo ra những điểm có hình thái học đồng nhất. Protein dễ bị biến tính và mất hoạt tính nhất tại bề mặt phân cách khí lỏng. Đây là vấn đề chủ yếu của những thí nghiệm thu nhỏ vì những điểm nanolit có tỷ lệ bề mặt trên thể tích cao và vì vậy sẽ bị bay hơi nhanh chóng. Để giảm sự bay hơi, protein microarray nên được in trong môi trường có độ ẩm cao (70”80 %) [30]. Tuy nhiên, các tấm nitrocellulose thực tế lại cần môi trường khô ráo cho việc kết dính protein tối ưu. Protein được tạo mảng có thể được bổ sung với tác nhân làm giảm sự bay hơi, chẳng hạn như 40 % (v/v) glycerol [30]. Đây là tác nhân xuất sắc sử dụng trong những mảng chức năng vì độ nhớt tăng làm giảm động năng của những phân tử dung môi tấn công, vì vậy bảo vệ protein khỏi sự biến tính. Tuy nhiên độ nhớt cao sẽ làm giảm tốc độ của sự cố định protein bằng cách giảm sự khuyếch tán trong điểm. Và những mẫu độ nhớt cao thì đặc biệt khó để tạo mảng với những kim in phân phối.
Đệm in phải được giữ càng đơn giản càng tốt, trừ khi có một lý do thuyết phục để sử dụng các điều kiện khác. Do đó, đối với nhiều protein microarray, việc sử dụng đệm ở nồng độ muối thấp hoặc sinh lý, pH trung tính cũng đủ đáp ứng [30]. Nhìn chung, một bề mặt ưa nước sẽ tạo ra những điểm đường kính lớn, trong khi những bề mặt kị nước sẽ tạo
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
ra những điểm nhỏ hơn. Sự hiện diện của nồng độ thấp chất tẩy nhẹ như polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20), sẽ giúp làm giảm các tương tác không đặc hiệu, và có thể cải tiến đáng kể hình thái của điểm bằng cách giảm sức căng bề mặt giữa đệm và bề mặt kính. Tuy nhiên những nồng độ cao hơn có thể làm cho những điểm lan ra trên bề mặt 2- D (hình 2.44).
Hình 2.44. Ảnh hưởng của chất tẩy lên hình thái của điểm trên protein array [30].
IgG được đánh dấu Cy3 (30µg/mL) được chuẩn bị trong PBS (Phosphate buffered saline), pH 7,4 không có Tween 20, và với 0,01% (v/v) và 0,05 (v/v) Tween 20. Những mẫu protein được tạo chấm 3 lần trên bản kính phủ Amine sử dụng một kim in đầu đặc 300µm. Sau khi khóa và rửa, mảng được quét tại 10µm. Những kết quả chứng minh rằng chất tẩy như Tween 20 ảnh hưởng lên hình thái điểm. Kết quả tốt nhất đạt được với 0,01% Tween.
Những dung môi ưa nước chẳng hạn như ethanol sẽ tạo ra những điểm lớn hơn và thúc đẩy sự biến tính protein. Những chất khối lượng phân tử lớn chẳng hạn như chất gôm hay polyvinylpyrrolidone có thể được thêm vào dung dịch in của những mảng kháng nguyên-kháng thể nhằm giảm lực đẩy tĩnh điện. Những mẫu protein cần pha loãng trước khi tạo mảng chỉ nên được pha loãng ngay lập tức trước khi sử dụng vì điều này có thể gây kết tủa protein. Đối với sự tạo vi mảng protein, việc dùng in tiếp xúc với những cây kim rắn đường kính 300 µm được đề nghị. Hình thái điểm đạt được chính xác khi tiếp xúc nhẹ, nói cách khác, thiết lập những dụng cụ phân phối để in ở độ sâu 3-10 μm dưới bề mặt tấm, sự tiếp xúc mạnh hơn có thể đẩy mẫu đến vòng ngoài điểm.
Thời gian cần để cố định mẫu dò protein trên tấm kính phụ thuộc vào nguyên tắc cố định. Theo kinh nghiệm, khi protein được cố định thông qua phản ứng cộng hóa trị thì quá trình cố định nhanh chóng, chỉ cần ủ trong 30 phút hoặc ít hơn, ngay cả khi có sự hiện diện của glycerol 40%. Quá trình này có thể được thực hiện trong môi trường ẩm ướt của thiết bị tạo mảng. Ngược lại, những tấm FAST của Schleicher & Schuell cần được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng để cho phép sự cố định trên những ma trận nitrocellulose. Sau đó, những mảng này nên được rửa nhanh để loại bỏ những protein không liên kết. Những tấm aldehyde nên được xử lý với 0,1mg/mL borohydride trong đệm bicarbonate, pH 9,0 trong 5 phút để dập tắt những nhóm hoạt động còn lại, hoặc đệm trung tính chứa BSA cũng tốt cho mục đích dập tắt, nó làm giảm những tương tác không đặc hiệu. Những array sau đó được
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
ủ trong dung dịch ngăn cản, chẳng hạn như PBS-Tween chứa hoặc sữa không béo hoặc BSA trong 30 phút tại nhiệt độ phòng hay qua đêm tại 4oC. Với những tấm polyacrylamide 3-D, do độ sâu của ma trận nên nó cần thời gian xử lý dài hơn.
Sau khi dập tắt những nhóm hoạt động và rửa, các mảng được ủ với mẫu mục tiêu. Thể tích tiêu biểu cho một slide là 25”500 µL, với nồng độ trong phạm vi từ pg/mL đến µg/mL phụ thuộc vào ứng dụng. Thời gian ủ mục tiêu và các điều kiện cần phải được xác định bằng thực nghiệm. Ủ lâu nên ơ ûđộ ẩm cao để tránh dung dịch mục tiêu bị khô, làm thay đổi nồng độ protein trong dung dịch. Sau khi ủ những array cần được rửa để loại bỏ những mục tiêu không liên kết, quá trình rửa được thực hiện vài lần với PBS-Tween và sau đó với PSB. Ở giai đoạn này luôn luôn có một sự thỏa hiệp giữa loại bỏ những protein mục tiêu không liên kết hay những protein liên kết không đặc hiệu và sự rủi ro của những protein liên kết đặc hiệu bị đánh bật. Có một số thiết bị xử lý slide tự động trên thị trường để tạo điều kiện chế tạo protein array của nhiều slide cùng một lúc.
Việc giảm nồng độ kháng nguyên khiến tín hiệu thu được suy yếu dần và sự hiện diện của một số lượng lớn những protein không phải kháng nguyên (huyết thanh) cũng làm giảm độ nhạy của phép đo bởi nó làm tăng sự phát huỳnh quang nền.