2.3.4.1. Đánh dấu huỳnh quang
Đánh dấu acid nucleic có trong mẫu bằng những phân tử phát huỳnh quang là phương pháp đơn giản nhất, được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện sự lai trên DNA array. Những kỹ thuật đánh dấu đã được mô tả như đánh dấu mồi ngẫu nhiên (random priming) , tổng hợp cDNA, khuyếch đại PCR, và sao chép trong ống nghiệm [36].
Nguyên tắc của phương pháp phát hiện sự lai dựa trên sự phát huỳnh quang rất đơn giản. Những acid nucleic đã đánh dấu được lai trên DNA microarray ở điều kiện nhiệt độ và có muối thích hợp để sao cho tín hiệu mạnh nhận được là những sản phẩm lai mong muốn và những tín hiệu yếu hơn là của sự ghép đôi không tương xứng. Sau đó, những phân tử DNA không liên kết sẽ được rửa bỏ, array sẵn sàng để được quét tín hiệu. Trong quá trình quét, một nguồn sáng có bước sóng tương ứng sẽ kích thích những phân tử thuốc nhuộm. Khi đó, những photon bị hấp thu bởi phân tử thuốc nhuộm sẽ phát xạ lại một phần ở tần số thấp hơn gọi là sự phát huỳnh quang [39]. Tiếp đó, hệ thống dò tìm đo lường và ghi lại ánh sáng huỳnh quang phát ra. Dựa trên bản chất nghiêm ngặt của array khác nhau, yêu cầu về thiết bị đo cũng không giống nhau.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Một loạt những phân tử thuốc nhuộm phát huỳnh quang với dấu hiệu quang phổ duy nhất được phát triển cho những nghiên cứu đánh dấu sinh học độ nhạy cao (hình 2.37). Trong đó, hai chiến lược đánh dấu được sử dụng rộng rãi trong phân tích microarray là hệ thống Cy3/Cy5 và hệ thống streptavidin/phycoerythrin. . Hệ thống sau được sử dụng cho công nghệ Affymetrix GeneChip® trong khi hệ thống Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi cho những cDNA microarray thương mại và tự chế [36].
Cyanine 3 (Cy3) và Cyanine 5 (Cy5) là những phân tử thuốc nhuộm thể hiện mức hiệu suất lượng tử cao, độ ổn định quang học vừa phải, quang phổ phát xạ và kích thích duy nhất. Đặc trưng của đánh dấu cDNA với chất nhuộm Cy3 và Cy5 là thực hiện phiên mã ngược sử dụng một mồi oligo(dT). Khi thực hiện đánh dấu mẫu bằng phân tử phát huỳnh quang, dUTP được đánh dấu Cy3 và dUTP được đánh dấu Cy5 sẽ được sáp nhập trên cDNA trong quá trình phiên mã ngược [36]. Nhờ những ưu điểm của Cy3 và Cy5 cho phép hiệu quả sàng lọc quang học cao và có thể phát hiện đồng thời 2 mẫu khác nhau trên một array đơn. Phương pháp đánh dấu Cy3/Cy5 hai màu thường được sử dụng để phân tích biểu hiện gen [39].
Giới hạn của kỹ thuật đánh dấu này là đòi hỏi một số lượng lớn RNA trên một phản ứng lai. Để sự phát huỳnh quang thích hợp, toàn bộ RNA đòi hỏi trên mẫu và array là khoảng 50 đến 200 microgram (hai đến năm microgram poly(A) mRNA được đòi
hỏi). Thậm chí với số lượng RNA này, tín hiệu của những bản sao hiếm vẫn có giới hạn phát huỳnh quang thấp hơn và thường khó để phân tách khỏi những tín hiệu nhiễu [36]. Từ đó, một vài sửa đổi được đề nghị để cải tiến sự phát hiện tín hiệu của những RNA bị giới hạn. Những phương pháp sản xuất ra nhiều bản sao mRNA sử dụng những RNA polymerase của thực khuẩn thể có hiệu quả cao đã được phát triển.
Hệ thống streptavidin/phycoerythrin đề cập ở trên là một phương pháp trong đó cRNA được đánh dấu biotin được tạo ra trực tiếp từ một cDNA có một vị trí promoter của T7 RNA polymerase tại đầu mút qua con đường sao chép trong ống nghiệm [36]. Sự phát hiện những phân tử được đánh dấu biotin được thực hiện bằng cách sử dụng streptavidin
Hình 2.37. Những thuốc nhuộm huỳnh quang thường [36].
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
liên kết với phycoerythrin. Sự khuyếch đại tín hiệu sau khi lai được thực hiện bằng cách ủ để biotin và streptavidin/phycoerythrin kết hợp với nhau.
Sự phát hiện huỳnh quang trở thành kỹ thuật phát hiện được sử dụng rộng rãi nhất cho những DNA microarray. Lý do chính cho điều này có thể là sự đánh dấu phát huỳnh quang là kỹ thuật đơn giản và đáng tin cậy, có một số lượng lớn thuốc nhuộm phát huỳnh quang và hệ thống phát hiện thương mại có thể sử dụng được.
Hiện nay, đang có nhiều nỗ lực để phát triển những phương pháp đánh dấu nhiều màu phân biệt nhằm tăng khả năng ứng dụng của DNA microarray. Trong ứng dụng xác định sự đa hình đơn nucleotide (SNP), những thuốc nhuộm phát huỳnh quang với 4 màu riêng biệt đã được sử dụng. Điều quan trọng cần lưu ý làsự phức tạp của bộ quét microarray sẽ tăng lên khisố lượng chất nhuộm phát huỳnh quang tăng, vì mỗi chất nhuộm đòi hỏi những bước sóng kích thích khác nhau.
2.3.4.2. Đánh dấu phóng xạ
Đánh dấu phóng xạ là kỹ thuật được biết đến đầu tiên để phát hiện và định lượng những trường hợp lai của mẫu dò acid nucleic mạch đơn với những phân tử đích mạch đơn tương ứng của chúng. Loại đánh dấu này được sử dụng rộng rãi trong Southern blot, Northern blot và lai tại chỗ. Thông thường, những DNA hay RNA sử dụng được đánh dấu với 32P, 33P, 3H hay 35S để lai với mục tiêu quan tâm.
32P được sử dụng nhiều nhất, phát tia - có năng lượng rất cao nên tín hiệu nhận được rõ và thời gian phơi sáng ngắn. Nhưng bên cạnh đó, 32P có 2 nhược điểm lớn: (1) chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải được sử dụng nhanh; (2) do năng lượng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận được không tinh mà khuyếch tán trên một vùng rộng. 35S phát tia có năng lượng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 ” 3 tháng) nên giúp giải quyết được 2 nhược điểm trên của 32P nhưng năng lượng thấp của tia mặt khác lại làm giảm độ nhạy của các phân tích nên ít được sử dụng để đánh dấu mẫu dò. 3H phát tia có năng lượng rất yếu , thời gian phơi sáng rất dài (nhiều tuần) nhưng bù lại tín hiệu rất tinh [4].
Vài kỹ thuật khác nhau được sử dụng để đưa tính phóng xạ vào bên trong những phân tử acid nucleic chẳng hạn như đánh dấu mồi ngẫu nhiên (random priming) hay khuyếch đại PCR sử dụng những oligonucleotide được đánh dấu phóng xạ như mồi PCR [36]. Sau quá trình lai, việc phát hiện phân tử lai được tiến hành nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography). Bằng cách sử dụng những phim X quang đơn giản, nhạy với tia xạ đặt lên vùng lai, ngay tại vị trí có phân tử lai, tia xạ do mẫu được đánh dấu phát ra sẽ in dấu lên phim, và dưới tác dụng của dung dịch hiện hình các tín hiệu sẽ hiện ra dưới dạng các chấm đen trên phim [4].
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Mặc dầu với sự đa dạng của các phương pháp phát hiện bằng sự phát huỳnh quang hay phát quang bằng phản ứng hóa học, sự phát hiện những phân tử acid nucleic được đánh dấu phóng xạ vẫn là kỹ thuật nhạy nhất có giá trị.
Sự sàng lọc khác nhau sử dụng những mẫu được đánh dấu với hai đồng vị phóng xạ khác nhau cũng có thể được thực hiện miễn là những nguyên tố phóng xạ có năng lượng khác nhau đáng kể chẳng hạn như 3H và 35S hay 3H và 33P [36].
Phương pháp phát hiện sử dụng những mẫu đánh dấu phóng xạ có hai bất lợi chính: (i) Việc sử dụng những mẫu đánh dấu phóng xạ chỉ hiệu quả với những array mật độ trung bình và thấp. Do năng lượng phát xạ rất mạnh của những mẫu đánh dấu phóng xạ nên tính ứng dụng của nó với những microarray thủy tinh mật độ cao bị hạn chế; (ii) Tính phóng xạ có hại cho sức khỏe con người, do đó hệ thống phát hiện này không phù hợp để sử dụng trong những phòng thí nghiệm chẩn đoán thông thường.
Bất chấp những trở ngại này, đánh dấu phóng xạ cung cấp một hệ thống phát hiện trực tiếp, nhanh và không đắt tiền. Những màng X quang đơn giản có thể được sử dụng để phát hiện và thiết bị cần thiết để hiện hình những màng X quang có sẵn trong hầu hết các cơ quan khám và điều trị bệnh.
2.3.4.3. Phát hiện dựa trên sự phát quang bằng phản ứng hóa học
Sự phát hiện dựa trên sự phát quang bằng phản ứng hóa học được sử dụng rộng rãi trong những phân tích sinh học để phân tích và định lượng những phân tử sinh học thông qua những phương pháp như lai tại chỗ, sắc ký cột chất lỏng, sự phân tách điện di mao dẫn, Southern, Northern, và Western blot.
Vài hệ thống phát hiện bằng phản ứng hóa học khác nhau được phát triển như đánh dấu digoxigenin và đánh dấu biotin [36]. Trong đánh dấu digoxigenin, mẫu được đánh dấu bằng cách sáp nhập với những nucleotide được đánh dấu digoxigenin bằng cách sử dụng phương pháp thiết lập mồi ngẫu nhiên, kỹ thuật nick translation, tổng hợp cDNA, khuyếch đại PCR, sao chép trong ống nghiệm, hay tổng hợp hóa học. Sau khi lai mẫu được đánh dấu digoxigenin với mẫu dò, DNA mạch kép được phát hiện bằng cách ủ với kháng thể đặc hiệu của digoxigenin, kháng thể này kết hợp với một enzyme (ví dụ, alkaline phosphatases được sử dụng rộng rãi nhất). Enzyme này sẽ xúc tác phản ứng chuyển cơ chất thành sản phẩm phát quang. Trong đánh dấu biotin, mẫu được đánh dấu bởi sự sáp nhập của những nucleotide được đánh dấu biotin bằng cách sử dụng những phương pháp đề cập ở trên. Thay vì một kháng thể đặc hiệu, streptavidin hay avidin được sử dụng để phát hiện mục tiêu được đánh dấu biotin. Trong phương pháp này, những enzyme kết hợp với phân tử (strept)avidin và những cơ chất tương tự được sử dụng.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Nói tóm tại, sự phát hiện dựa trên sự phát quang bằng phản ứng hóa học có một vài thành tựu so với những kỹ thuật đánh dấu và phát hiện khác: (i) dễ sử dụng, (ii) đủ nhạy và đặc hiệu, (iii) không chiếu xạ hay gây nhiễm với những mối nguy hiểm, (iv) phạm vi phát hiện động lực/tuyến tính cao, (v) chi phí thiết bị thấp (so với những phim X quang hay hệ thống camera), (vi) có thể sử dụng lại những array.
Những bất lợi thường đi kèm với sự phát hiện bằng những phản ứng hóa học là: (i) độ nhạy thấp hơn so với đánh dấu phóng xạ, (ii) tín hiệu nền cao hơn, (iii) tính đặc hiệu thấp hơn. Tuy nhiên, mặc dầu sự phát hiện bằng những phản ứng hóa học hiếm khi được sử dụng trong những microarray, nó vẫn là một sự chọn hứa hẹn so với những chiến lược đánh dấu khác như huỳnh quang hay kỹ thuật phóng xạ tự ghi.