2.3.5.1. Phân tích biểu hiện gen sử dụng DNA microarray
Để phân tích biểu hiện gen, những acid nucleic mà có trình tự tương ứng với mRNA cần đo sẽ được gắn lên bề mặt array. Nhìn chung, sẽ không hữu dụng nếu lai trực tiếp mRNA từ mẫu mô với array, vì không có hệ thống phát hiện thích hợp dùng cho những acid nucleic không được đánh dấu. Vì lý do đó, mRNA thường được phiên mã ngược thành cDNA. Bởi vì hiệu suất thấp của quá trình phiên mã ngược và số nguyên liệu khởi đầu thường ít (ví dụ, từ sinh thiết mô hay từ mẫu máu), số lượng cDNA thu được quá thấp cho hầu hết các ứng dụng. Vì lý do này, cDNA phải được khuyếch đại. Tuy nhiên, quan trong là phải chọn được ra một phương pháp mà tránh làm thay đổi tỷ lệ của những loại acid nucleic với nhau. Hai kỹ thuật thường được sử dụng, PCR với số chu kỳ thấp và sao chép trong ống nghiệm [36]. Trong trường hợp sao chép trong ống nghiệm, một promoter cho RNA polymerase được thêm vào chuỗi cDNA trong suốt quá trình phiên mã ngược mRNA từ mẫu. cDNA sau đó được khuyếch đại 100 đến 1000 lần bằng cách sử dụng RNA polymerase. Trong suốt quá trình sao chép trong ống nghiệm, những phân tử RNA thường được đánh dấu huỳnh quang. Tuy nhiên, nếu RNA không định ra giới hạn thí ngiệm, thì cDNA được đánh dấu có thể trực tiếp được sử dụng để lai với array.
Có hai cách thông thường có giá trị để đánh giá biểu hiện gen và đặc biệt là để đánh giá sự khác nhau trong biểu hiện gen giữa những mẫu khác nhau [24, 36]. Trong phương pháp đầu tiên, acid nucleic được đánh dấu từ hai mẫu đem so sánh được lai với hai array giống nhau. Để chuẩn hóa cường độ tín hiệu của những gen đơn, những tiêu chuẩn nội bộ hay phương pháp thống kê phức tạp được sử dụng. Thông thường, những ‚gen giữ nhà‛ (housekeeping gen) có tỷ lệ biểu hiện đều đặn có thể được sử dụng như những tiêu
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
chuẩn nội bộ. Ngoài ra, cường độ tín hiêu trung bình được tính toán và sử dụng để tiêu chuẩn hóa. Cuối cùng, sự khác nhau trong cường độ tín hiệu đã được tiêu chuẩn hóa chỉ ra tỷ lệ biểu hiện khác nhau.
Phương pháp thứ hai để so sánh biểu hiện gen chỉ cần một array cho hai mẫu. Trong trường hợp này, hai mẫu được đánh dấu khác nhau, thường bằng 2 chất nhuộm phát huỳnh quang khác nhau, ví dụ Cy3 (với bước sóng hấp thu 552 nm và bước sóng phát ra là 568 nm) và Cy5 (với bước sóng hấp thu 650 nm và bước sóng phát ra là 667 nm). Sự lai trên array được thực hiện bằng cách sử dụng tỷ lệ 1:1 của những mẫu dò acid nucleic được đánh dấu. Những gen với mức độ biểu hiện giống nhau được đại diện là màu hỗn hợp, trong khi những gen với tỷ lệ biểu hiện khác nhau, một trong những màu phát huỳnh quang sẽ trội hơn màu kia. Phương pháp được mô tả ở trên thường được tiến hành cho những array gồm sản phẩm PCR và plasmid.
Lợi thế của phương pháp này là quá trình thực hiện đơn giản. Tuy nhiên, một hỗn hợp chứa nhiều phân tử acid nucleic khá dài và khác nhau dẫn đến tính không đồng nhất trong động học quá trình lai là một bất lợi. Lý do là những điều kiện lai như nhiệt độ và nồng độ muối không bao giờ là tối ưu cho tất cả các phân tử. Từ đó, kết quả là sự lai không hoàn toàn hay không đặc hiệu có thể xảy ra dẫn đến những kết quả sai. Ngoài ra, vì những acid nucleic gắn lên chất nền trong hình dạng ngẫu nhiên, nhiều trường hợp sẽ không có giá trị để lai với DNA trong mẫu vì lý do không gian. Cách giải quyết cho vấn đề này nằm ở việc sử dụng những oligonucleotide microarray gồm có những mẫu dò acid nucleic dài khoảng 15 đến 25 base (thỉnh thoảng lên tới 60 base). Những oligonucleotide này có thể được chọn lọc theo đặc tính hóa học của chúng để đảm bảo quá trình lai được tối ưu.
Công ty Affymetrix (Santa Clara, San Diego, USA) đã đưa ra cách giải quyết thích hợp cho vấn đề này. Gần đây, những array của họ sử dụng 11 đến 12 oligonucleotide 25- mer khác nhau để giám sát mỗi một mRNA. Những oligonucleotide này trên microarray bổ sung chính xác với nhiều trình tự khác nhau trong vùng 3’ không được dịch mã của mRNA và vì vậy được gọi là những oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình.2.38. Ảnh huỳnh quang của oligonucleotide microarray [36].
Array được lai với mẫu cRNA thu được từ mRNA của nấm men được nuôi cấy. Những tế bào nấm men phát triển cả trong môi trường giàu và nghèo chất dinh dưỡng tại 300C. Những
vùng đánh dấu cho thấy những oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo và bắt cặp sai mô tả những RNA được biểu hiện với cường độ khác nhau trong hai mẫu nuôi cấy.
Giống như một đối chứng âm được thêm vào với những oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo, microarray của Affymetrix chứa cùng một số lượng oligonucleotide bắt cặp sai. Những oligonucleotide này khác với những trình tự bắt cặp hoàn hảo ở chỗ có sự hiện diện của một base bắt cặp sai ở giữa oligonucleotide. Trong trường hợp lý tưởng, những oligonucleotide bắt cặp sai sẽ không xảy ra quá trình lai, từ đó tín hiệu nhận được là lai không đặc hiệu. Sự khác nhau trong cường độ tín hiệu giữa những oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo và không hoàn hảo cho phép đánh giá liên kết không đặc hiệu. Một thuật toán tính toán cường độ chính xác của oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo, sau đó đem so sánh với cường độ của array thứ hai được lai với mẫu dò khác. Sự khác nhau về cường độ tín hiệu giữa hai mẫu cho thấy số lượng mRNA khác nhau, từ đó suy ra mức độ biểu hiện khác nhau của gen quan tâm trong hai mẫu.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình 2.39. Phân tích biểu hiện gen với oligonucleotide array mật độ cao [36]. Sử dụng các mẫu dò có chiều dài 25mer bắt cặp hoàn hảo và những oligonucleotide bắt cặp
sai, chỉ khác với oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo ở một base đơn tại trung tâm oligonucleotide. So sánh cường độ tín hiệu giữa mẫu dò bắt cặp hoàn hảo và bắt cặp sai để
quyết định tính đặc hiệu của liên kết. Vùng 1 (ô thứ nhất) chỉ ra một ví dụ nơi mà mẫu không lai với cả oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo và bắt cặp sai; vùng này được lấy ra để đánh giá. Vùng 3 không được sử dụng để đánh giá vì mẫu lai với cả oligonucleotide bắt cặp
hoàn hảo và không hoàn hảo với cường độ bằng nhau, chỉ ra sự lai không đặc hiệu. Tất cả những vùng khác được thừa nhân là lai đặc hiệu và được đưa ra để phân tích.
2.3.5.2. Sắp xếp lại trình tự bằng phương pháp lai
Đáng chú ý là sự sử dụng của microarray không chỉ giới hạn để phân tích biểu hiện gen. Sử dụng những oligonucleotide array mật độ cao để xác định lại trình tự bằng phương pháp lai cho phép nhận diện những chủng đột biến và sự đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism _ SNP) trong những trình tự gen được biết [24, 36]. Những nucleotide bổ sung với những phần xác định của gen được cố định trên DNA microarray. Sau khi khuyếch đại và đánh dấu, mẫu nghiên cứu được lai với những oligonucleotide trên array. Sử dụng một array chứa những oligonucleotide bổ sung với mỗi 4 base tại mỗi vị trí cho phép một trình tự DNA chưa biết trong mẫu được xác định hiệu quả dựa trên mẫu lai đơn (hình 2.40).
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình 2.40. Xác định trình tự của DNA sử dụng oligonucleotide microarray [36]. Mẫu chỉ lai với những oligonucleotide có trình tự bắt cặp hoàn hảo. Bởi vì vị trí và trình tự của oligonucleotide trên array được biết nên trình tự của mẫu có thể được suy ra từ mẫu lai.
Trục x chỉ ra trình tự đọc được từ mẫu lai trên array, trục y xác định sự nhận diện của base tại vị trí trên array.
Hiện nay, xác định trình tự bằng phương tiện DNA array bị giới hạn bởi những khó khăn về điều kiện lai tối ưu, vì vậy sự củng cố những thay đổi nào đó được tìm thấy là cần thiết trước khi kỹ thuật này có thể được sử dụng cho những mục đích chẩn đoán trong y học. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể dễ xảy ra sai sót nếu có nhiều sự thay đổi hay có sự lệch hướng trình tự phức tạp. Vì những lý do này, phương pháp xác định trình tự truyền thống hiện nay vẫn là phương pháp hiệu quả hơn nhiều. Tất nhiên trong tương lai, vị trí này có thể thay đổi với những lợi thế trong array và thiết kế thí nghiệm cũng như với sự phát triển của tin sinh học.
Những array phát hiện đột biến này được sử dụng để phân tích toàn bộ 16,5 kb trình tự của mẫu DNA mitochondrial, 9,2 kb mã trình tự của gen ATM, những mã đột biến BRCA1, những đột biến p53, sự thay đổi cytochrome P450 liên quan đến sự chuyển hóa thuốc và những biến thể trình tự của HIV. Ba array cuối là những sản phẩm thương mại có giá trị gần đây của Affymetrix. [24]
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip 2.4. Protein Microarray
2.4.1. Từ DNA array đến protein array và thách thức
Sự phát triển của DNA array là sự hội tụ của hai lĩnh vực rất khác nhau: di truyền học phân tử và điện tử máy tính. Ngày nay, những DNA microarray với hàng chục ngàn mẫu dò oligonucleotide trên một centimet vuông đã trở thành phương pháp được lựa chọn để phân tích định lượng cao các acid nucleic ở cấp độ phiên mã của chúng. Sự sử dụng những DNA microarray để phân tích các chuỗi dữ liệu đã liên kết chức năng của các nhóm gen với những con đường trao đổi chất thông thường. Tuy nhiên, DNA microarray không đưa ra được những cái nhìn sâu sắc về chức năng của các gen riêng lẻ vì hoạt động phiên mã không nhất thiết phản ánh việc sản xuất hay hoạt động của các protein được dịch mã. Thật vậy, mối tương quan giữa mRNA và mức độ protein có thể rất yếu. Những lý do chính cho điều này là kích thước những bản sao DNA và oligonucleotide không kể đến những biến đổi qua quá trình dịch mã hay tỷ lệ thu hồi protein. Vì vậy, sự thống nhất hiện nay là phân tích các biểu hiện và tương tác của protein sẽ cung cấp một cách tiếp cận tốt hơn để làm sáng tỏ chức năng gen. Một lý do quan trọng thứ hai của sự cần thiết tạo những mảng protein array và nghiên cứu sự tương tác của chúng là hầu như tất cả các loại thuốc được phát hiện cho đến nay phát huy hiệu lực của mình thông qua các tương tác protein. Việc chuyển hướng nghiên cứu những protein trên quy mô lớn, tiến hành song song sẽ đòi hỏi một mô hình thay đổi khác với những nghiên cứu protein thông thường, những nghiên cứu mà chỉ tập trung vào một protein duy nhất tại một thời điểm nghiên cứu. Tuy nhiên trở ngại quan trọng nhất phải vượt qua là làm thế nào để đối phó với tính chất đa dạng của chính những protein. Những acid nucleic được tạo thành chỉ từ 4 nucleotide cơ sở và có một xương sống ưa nước, tích điện âm. Ngược lại, những protein được tạo thành từ 20 amino acid khác nhau, và có thể là ưa nước hay kị nước, acid hay base. Điều này dẫn đến tính đa dạng về khả năng hòa tan, cấu trúc bậc ba và những vị trí hoạt động, điều mà tạo ra cho mỗi protein một chức năng riêng.
Nhìn chung, protein kém bền hơn so với acid nucleic, do đó, các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ ẩm trên protein array cần có sự kiểm soát nghiêm ngặt hơn trên DNA array. Một số protein có khả năng chịu được sự nhiễu loạn bên ngoài cấu trúc của chúng và nói chung là ứng cử viên tốt để tạo mảng protein, ví dụ như những kháng thể, trong khi các protein khác rất không ổn định, khó có thể duy trì được chức năng khi được cố định bên ngoài môi trường bản địa của chúng.
Ngoài ra, số lượng protein nhiều hơn gen, sự đánh giá gần đây nhất dự đoán rằng hệ gen của con người có khoảng 30 000 gen, nhưng có thể có đến 1 000 000 cấu trúc
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
protein trong hệ protein của con người. Hệ protein thì phức tạp hơn hệ gen bởi 3 lý do quan trọng: (1) nhiều gen mã hóa cho nhiều biến thể của một protein (những biến thể ghép nối); (2) nhiều protein được biến đổi qua quá trình dịch mã bằng cách kết hợp theo những cách khác nhau; và (3) hệ protein thì luôn thay đổi, kiểu hình protein tiến triển trong suốt thời gian khởi phát và tiến triển của bệnh, và thậm chí từ phút này qua phút khác xuất phát từ những nhu cầu cần thiết của sự thay đổi sinh vật.
Có rất nhiều cấu trúc protein cơ bản trong một hệ protein, từ đó có thể đánh giá rằng số lượng tương tác protein ” protein tự nhiên là rất lớn. Một xem xét quan trọng khi tạo mảng những protein để nghiên cứu tương tác là khi các protein tiến hóa cấu hình phù hợp nhất để tương tác với những đối tác protein tương ứng của chúng, chúng có thể đã phát triển một cơ chế để loại trừ các mối tương tác không mong muốn với các protein khác cùng tồn tại trong một môi trường không gian riêng biệt. Điều này đặc biệt quan trọng khi tập hợp những protein lại cái mà vốn được chia thành nhiều loại.
Tóm lại, việc sản xuất protein array phức tạp hơn và đòi hỏi chi phí cao hơn so với DNA array. Sự khác biệt cớ bản giữa DNA array và protein array được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. So sánh giữa DNA chip và protein chip [3]
Đặc điểm DNA Protein
Cấu trúc Giống nhau, xây dựng từ 4 nucleotide
Khác nhau, xây dựng từ 20 amino acid có thể được biến đổi sau dịch mã
Chức năng Khi ở trạng thái biến tính Cần ở cấu trúc 3-D
Bảo quản Có thể bảo quản khô Cần bảo quản ở các điều kiện ‚tự nhiên‛ Lực tương tác Lai (gắn kết) Gắn kết Các khả năng tương tác DNA-DNA DNA-RNA (DNA-protein) (RNA-protein) Protein-protein Protein-peptide Protein-chất gắn kết (ví dụ, kháng thể) Protein-phân tử nhỏ Thụ thể-phối tử Protein-DNA Protein-RNA Sản xuất Nhân bản thông qua PCR
Sản xuất trong E. coli
Protein biểu hiện ở các hệ thống biểu hiện prokaryote và eukaryote khác nhau
Tính tan Có thể tan trong các dung
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
2.4.2. Các loại protein microarray
Protein microarray được phát triển thành nhiều loại khác nhau, tóm tắt trong bảng 2.2 [30]. Nguyên tắc của những array kháng thể (antibody array) và array kháng nguyên là sử dụng những phối tử ái lực cao để phát hiện sự hiện diện của những protein cụ thể và những dấu hiệu sinh học trong một hỗn hợp phức tạp. Knezevic et al. chọn 368 kháng thể đặc trưng cho những protein liên quan đến ung thư để chế tạo array. Sự tiếp xúc của những array với 6 loại dịch thủy phân mô học xác định được 11 protein cho thấy sự thay đổi tương ứng trong biểu hiện hay trạng thái của sự phosphoryl hóa. Sreekumar et al. sử dụng một array với 146 kháng thể riêng biệt để theo dõi sự thay đổi của các mức protein trong những tế bào ung thư biểu mô ruột già [30].
Bảng2.3. Những loại protein microarray [30]
Loại array Mô tả
Array kháng thể (Antibody array)
Những kháng thể đơn dòng hay đa dòng được tạo mảng và được sử dụng để phát hiện và định lượng những protein cụ thể trong một mẫu sinh học. Một mảng kháng thể có hiệu quả như một loạt những nghiên cứu miễn dịch song song.
Array kháng nguyên hay đảo ngược
Ngược với mảng kháng thể, chip này cố định những kháng nguyên được sử dụng để phát hiện và định lượng những kháng thể trong một mẫu sinh học.
Array chức năng (Functional array)
Protein tinh khiết được tạo mảng trên bề mặt và được sử dụng để phát hiện và mô tả đặc điểm của những tương tác protein ” protein, protein ” DNA, protein ” những phân tử nhỏ.
Array bắt giữ (Capture array)
Những phân tử không phải protein tương tác với những phân tử