Lab-on-a-chip là một công cụ mới và có tính cách mạng cho các ứng dụng trong sinh học và hóa học. Ý tưởng của phòng thí nghiệm trên một con chip (lab-on-a-chip) là giảm bớt các phòng thí nghiệm sinh học, hóa học với một hệ thống vi mô, kích thước cầm tay hoặc nhỏ hơn. Hệ thống lab-on-a-chip có thể được làm bằng thủy tinh, silicon và các vật liệu cao phân tử, và kích thước vi kênh điển hình trong khoảng vài chục đến vài trăm μm. Những mẫu chất lỏng hay chất phản ứng có thể được vận chuyển thông qua các vi kênh từ buồng chứa đến nơi phản ứng bằng cách sử dụng điện động, từ trường hoặc các phương pháp bơm thủy động lực. Sự vận động của lưu chất có thể được giám sát bằng cách sử dụng các cảm biến khác nhau [11].
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Có rất nhiều lợi thế khi sử dụng phòng thí nghiệm trên một con chip hơn là những phòng thí nghiệm sinh học hay hóa học truyền thống. Một trong những lợi thế quan trọng nằm ở chi phí thấp. Nhiều thuốc thử và hóa chất sử dụng trong các phản ứng sinh học và hóa học rất tốn kém, vì vậy triển vọng của việc sử dụng một lượng rất nhỏ (trong phạm vi micro đến nanolit) của thuốc thử và hóa chất cho một ứng dụng là rất hấp dẫn. Một lợi thế nữa là phòng thí nghiệm trên một con chip đòi hỏi một lượng rất nhỏ thuốc thử/hóa chất nên cho phép phối trộn và phản ứng nhanh. Phản ứng sinh hóa chủ yếu liên quan đến sự khuyếch tán của hai chất hóa học hoặc tác nhân sinh học, lưu chất ở mức vi mô sẽ làm giảm thời gian khuyếch tán và như vậy làm tăng xác suất phản ứng. Trên thực tế, các sản phẩm phản ứng có thể được tạo ra trong một vài giây/phút, trong khi phòng thí nghiệm quy mô có thể mất hàng giờ hay thậm chí nhiều ngày. Ngoài ra, hệ thống lab-on-a-chip giảm thiểu tối đa các sản phẩm có hại vì thể tích của chúng quá nhỏ. Những phản ứng phức tạp của nhiều tác nhân có thể xảy ra trên lab-on-a-chip có tiềm năng cơ bản trong phân tích DNA, phát hiện những tác nhân chiến tranh sinh hóa, phân loại tế bào/phân tử sinh học, phân tích máu, phát triển và sàng lọc thuốc, tổ hợp hóa học và phân tích protein.
2.2.3.1. Hệ thống phát hiện sinh hóa dựa trên những hạt từ micro
Nhóm BioMEMS tại đại học Cincinnati đã phát triển một hệ thống microfluidic để phát hiện sinh hóa và phân tích y sinh, dựa trên ý tưởng của nghiên cứu miễn dịch sandwich, và những kỹ thuật phát hiện điện hóa [11]. Hệ thống microfluidic này dùng để phát hiện những phân tử sinh học, chẳng hạn như những protein đặc biệt và/hoặc kháng nguyên trong các mẫu chất lỏng.
Hình 2.13. Phân tích dựa trên nghiên cứu miễn dịch và phát hiện điện hóa
[11].
Ý tưởng phân tích dựa trên xét nghiệm miễn dịch sandwich và phát hiện điện hóa được minh họa trong hình 2.13. Những hạt từ đóng vai trò là chất nền của kháng thể và chất mang của những kháng nguyên đích. Một ý tưởng đơn giản của lấy mẫu sinh học bằng những hạt từ với nam châm điện dựa vào những nghiên cứu miễn dịch được thể hiện trong hình 2.14.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình 2.14. Cách thức lấy mẫu sinh học và nghiên cứu miễn dịch [11].
a) Tiêm hạt từ; b) phân tách và giữ hạt từ; c) thêm mẫu; d) cố định kháng nguyên đích; e) thêm kháng thể đánh dấu; f) phát hiện điện hóa; g) loại bỏ những hạt từ và sẵn sàng cho
nghiên cứu miễn dịch khác.
Những hạt từ phủ kháng thể được đưa lên nam châm điện và được phân tách bằng cách áp vào những vùng có từ tính. Trong khi giữ các hạt từ phủ kháng thể, những kháng nguyên được thêm vào kênh. Chỉ những kháng nguyên đích được cố định và do đó được phân tách trên bề mặt hạt từ nhờ phản ứng kháng nguyên/kháng thể. Những kháng nguyên khác được rửa ra ngoài theo dòng chảy. Tiếp theo, những kháng thể thứ cấp có đánh dấu enzyme được đưa vào và ủ cùng với những kháng nguyên được cố định. Sau đó, rửa để loại bỏ tất cả những kháng thể thứ cấp không liên kết. Dung dịch cơ chất của enzyme được thêm vào trong kênh, và sự phát hiện điện hóa được thực hiện. Cuối cùng, những hạt từ được phóng thích tới những khoang chất thải và thiết bị phân tách sinh học sẵn sàng cho một xét nghiệm miễn dịch khác.
Alkaline phosphatase (AP) và phosphate p-aminophenyl (PAPP) lần lượt được lựa chọn là enzyme và cơ chất điện hóa. Alkaline phosphatase làm cho PAPP chuyển thành sản phẩm điện hóa của nó, p-aminophenol (PAP). Bằng cách áp vào điện thế, PAP cho điện tử và chuyển thành 4-quinoneimine (4QI), hình thức oxy hóa của PAP.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Để xét nghiệm miễn dịch thành công, bộ lọc sinh học và cảm biến miễn dịch được chế tạo riêng biệt và tích hợp với nhau. Bộ lọc sinh học và cảm biến miễn dịch đã tích hợp được gắn lên bề mặt một bo mạch vi lưu, chứa những vi kênh được chế tạo bằng khắc thủy tinh và kỹ thuật liên kết trực tiếp thủy tinh với thủy tinh [11]. Mỗi lối vào và lối ra được kết nối với những khoang chứa mẫu thông qua những vi van. Hình 2.15 cho thấy hệ thống phát hiện sinh hóa microfluidic tích hợp dùng cho nghiên cứu miễn dịch dựa trên những hạt từ.
Hình 2.15. Lab-on-a-chip được chế tạo dùng cho nghiên cứu miễn dịch dựa trên những hạt từ [11].
Sau khi kiểm tra thứ tự chất lỏng, những nghiên cứu miễn dịch đầy đủ được thực hiện trong hệ thống microfluidic tích hợp để chứng thực sự phát hiện sinh hóa dựa trên những hạt từ và chức năng lấy mẫu. Những hạt từ (Dynabeads® M-280, Dynal Biotech Inc.) được phủ với globulin miễn dịch G (IgG) của cừu kháng chuột (đã biotinyl hóa) được tiêm vào khoang phản ứng và được phân tách trên bề mặt của bộ lọc sinh học bằng cách áp vào những miền từ trường [11]. Trong khi giữ những hạt từ, kháng nguyên (IgG chuột) được tiêm vào trong buồng phản ứng và ủ.
Sau đó kháng thể thứ cấp được đánh dấu (IgG kháng chuột tích hợp với alkaline phosphatase) và cơ chất điện hóa (PAPP) của alkaline phosphatase được bổ sung sau đó và tiến hành ủ để đảm bảo sự sản xuất PAP. Sự phát hiện điện hóa sử dụng một phương pháp phát hiện dựa trên việc đo cường độ dòng điện theo thời gian. Sau khi phát hiện, những hạt từ với tất cả những chất phản ứng được rửa hết, và hệ thống sẵn sàng cho một nghiên cứu miễn dịch khác. Trình tự này được lặp lại với mỗi nghiên cứu miễn dịch mới. Tốc độ dòng chảy được thiết lập trong từng bước là 20 µL/phút [11].
Sau sự hiệu chuẩn của cảm biến miễn dịch điện hóa, những nghiên cứu miễn dịch đầy đủ được thực hiện theo trình tự nêu trên với nồng độ kháng nguyên khác nhau: 50, 75, 100, 250, và 500 ng/mL. Nồng độ hạt từ được phủ kháng thể sơ cấp và nồng độ kháng thể thứ cấp tích hợp lần lượt là 1,02×107 hạt từ/mL và 0,7 µg/mL [11]. Những kết quả nghiên
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
cứu miễn dịch với những nồng độ kháng nguyên khác nhau được chỉ ra trong hình 2.16. Tổng thời gian nghiên cứu ít hơn 20 phút, bao gồm tất cả các bước ủ và phát hiện.
Hình 2.16. Kết quả nghiên cứu miễn dịch đo được bằng phương pháp phát hiện dựa vào việc đo ampe theo thời gian [11].
Phương pháp luận và hệ thống cũng được áp dụng để phát hiện những phân tử sinh học chung bằng cách thay thế kháng thể/kháng nguyên với những tác nhân/thụ quang sinh học (bioreceptor) thích hợp, chẳng hạn những đoạn DNA hay oligonucleotide, để ứng dụng cho phân tích DNA và/hay phân tích protein định lượng cao [11].
2.2.3.2. Lab-on-a-chip thông minh dùng một lần cho phân tích máu
Thiết bị lab-on-a-chip thông minh dùng một lần bao gồm những bộ phận của hệ thống microfluidic bằng plastic được tích hợp để điều khiển chất lỏng, cảm biến sinh học và hóa học, và bộ điều chỉnh điện tử. Biochip này có mục tiêu cụ thể là phát hiện và nhận diện 3 thông số của sự trao đổi chất: PO2 (áp suất riêng phần của oxi), lactate và glucose từ một mẫu máu [11]. Ý tưởng dưới dạng sơ đồ của lab-on-a-chip dùng một lần dạng hộp dùng trong phân tích máu được minh họa trong hình 2.17. Những hộp lab-on-a-chip có sẵn được chế tạo bằng cách sử dụng thuật tiêm khuôn plastic và kỹ thuật liên kết trực tiếp plastic với plastic. Hộp biochip bao gồm một hệ thống vi phân phối dựa trên kỹ thuật sPROMs (hệ thống vi lỏng lập trình cấu trúc), một máy nổ, nguồn áp suất trên chip và những cảm biến sinh học điện hóa [11].
Một bộ phân phối vi lỏng thụ động phân phối chính xác lượng mẫu cần phân tích, và sau đó nguồn năng lượng từ ‚máy nổ‛ trên chip được làm ‚nổ‛ để đẩy mẫu chất lỏng được đánh dấu từ khoang phân phối. Khi không khí bị nổ, mẫu chất lỏng được đánh dấu di chuyển qua những kênh vi lỏng vào trong khoang cảm nhận, bên dưới khoang này mảng cảm biến sinh học được định vị, hình 2.17.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.17. Lab-on-a-chip bằng plastic thông minh, sử dụng một lần [11].
Mảng cảm biến sinh học bao gồm một cảm biến oxygen và một cảm biến glucose được chế tạo bằng cách sử dụng kỹ thuật in lụa [11]. Những cảm biến sinh học có thể thực hiện việc đo lường dựa trên lượng mẫu cực nhỏ (khoảng 100nL). Cảm biến glucose được thiết kế bằng cách thêm 2 lớp bổ sung lên trên cảm biến oxygen, là những lớp màng bán thấm glucose và lớp glucose oxidase (GOD).
Hình 2.18. Nguyên tắc hoạt động của biosensor cảm biến nồng độ oxy riêng phần [11].
Nguyên tắc của cảm biến oxy là đo cường độ dòng điện khi oxy khuyếch tán từ mẫu đến bề mặt điện cực được bão hòa, có nghĩa là dạng phân phối gradient oxy không đổi được tạo ra, dòng điện lúc này chỉ tương ứng với nồng độ oxy trong dung dịch. Một lớp silicon được phủ quay (spin-coated) và được dùng như một màng bán thấm oxy bởi vì tính thấm cao của nó và tỷ lệ tín hiệu nhiễu thấp. Những phân tử nước xuyên qua màng silicon
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
và khôi phục chất điện phân dạng gel vì ion Cl- có thể di chuyển đến gần cực dương để kết hợp với Ag+. Số điện tử trong phản ứng này được đếm bằng hệ thống đo lường.
Đối với cảm biến glucose, các lớp bổ sung _ màng bán thấm glucose (polyurethane) và GOD được cố định (trong gel polyacrylamide) _ cho phép sự chuyển trực tiếp từ cảm biến oxy đến một cảm biến glucose. Phân tử glucose đi xuyên qua lớp bán thấm và bị oxy hóa ngay lập tức bởi GOD. Cảm biến oxy sẽ đo hydrogen peroxide, một sản phẩm phụ của sự oxi hóa glucose. Mức độ hydrogen peroxide tương ứng với mức độ glucose trong mẫu. Những hộp lab-on-a-chip bằng plastic dùng một lần sau khi chế tạo được lồng vào trong một dụng cụ phân tích biochip loại cầm tay sử dụng cho phân tích mẫu máu người, hình 2.19. Dụng cụ phân tích biochip nguyên mẫu bao gồm mạch phát hiện cảm biến sinh hóa, mạch điều khiển trình tự và tính toán thời gian cho nổ khí, nguồn năng lượng trên chip, và một đơn vị hiển thị [11]. Dụng cụ phân tích biochip hoạt động bằng pin bắt đầu trình tự cảmbiến và hiển thị kết quả đọc được trong 1 phút. Mức glucose và PO2 đo được trong mẫu máu người được thể hiện trong hình 2.30.
Hình 2.19. Dụng cụ phân tích lab-on-a- chip thông minh dùng một lần loại cầm tay [11].
Hình 2.20. Kết quả đo được từ bộ biochip và dụng cụ phân tích [11]. (a) đường cong định cỡ PO2 và (b) mức glucose.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Biochip được phát triển có chi phí thấp, hệ thống dựa trên plastic, chúng có thể ứng dụng 1 lần cho giám sát những thông số quan trọng về phương diện lâm sàng như PO2, glucose, lactate, hematocrit và pH. Dụng cụ chỉ thị sức khỏe này cung cấp một hệ thống cảnh báo sớm cho phát hiện tình trạng bệnh nhân và cũng có thể phục vụ như những dấu hiệu để giám sát bệnh và độc tính.
2.2.3.3. Microfluidic biochip dùng một lần cho phân loại nhóm máu
Phân loại nhóm máu là xét nghiệm quan trọng nhất đối với cả người cho máu và nhận máu. Ý nghĩa then chốt của phân loại nhóm máu, đặc biệt là nhóm máu ABO, xuất phát từ thực tế là tất cả những ngưng kết tố của hệ thống ABO sẽ làm đông đặc phần bù và thậm chí có thể gây tán huyết nội mạch của hồng cầu không tương thích. Vì vậy, một sự phân loại sai nhóm máu ABO của người cho hay nhận gây ra những kết quả bi thảm không mong muốn.
Nhóm máu thường được xác định bằng cách quan sát kết quả ngưng kết của tế bào hồng cầu (red blood cell _ RBC) phản ứng với huyết thanh tương ứng. Sự ngưng kết hồng cầu chỉ ra sự hiện diện của kháng nguyên trong hồng cầu tương ứng với kháng thể trong huyết thanh. Nhóm máu ABO có thể xác định bằng 2 phương pháp phân loại khác nhau [31]: phân loại tế bào hồng cầu và phân loại huyết thanh. Phân loại hồng cầu có 7 nhánh kiểm tra, gồm hồng cầu mẫu với huyết thanh Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-A1, Anti-H, Anti-D tiêu chuẩn và đối chứng âm, để xác định nhóm máu A, B, AB, O, Rh (D) và cả A yếu. Anti-A1 và Anti-H được sử dụng để xác định những phân nhóm máu yếu, đối chứng âm để kiểm tra sự tự ngưng kết của mẫu máu. Đối với phân loại huyết thanh, có 3 nhánh kiểm tra, gồm huyết thanh mẫu với hồng cầu -A, -B, -O tiêu chuẩn, nó có thể áp dụng để xác định kết quả kiểm tra của phân loại tế bào hồng cầu.
Mục đích của việc phân loại hồng cầu và huyết thanh là để xác nhận kết quả ngưng kết của nhau. Bằng cách phân loại này, mẫu máu kiểm tra sẽ được xác định chính xác là A, B, AB hay O do những tế bào hồng cầu ngưng kết với nhau khi chúng phản ứng với huyết thanh của nhóm máu tương ứng, Anti-A hay Anti-B. Anti-A, Anti-B và Anti-AB lần lượt thu được từ huyết thanh của những người nhóm máu B, A, O. Cần lưu ý là Anti-AB không phải là hỗn hợp đơn giản của Anti-A và Anti-B mà là huyết thanh riêng biệt của những người có nhóm máu O, được ứng dụng để xác định những kháng nguyên yếu của tế bào hồng cầu, cụ thể là những kháng nguyên yếu A (ví dụ, A2, A3, Aint,...)1. Ngoài ra có những phân nhóm của A và B, được phân loại như A yếu (weak-A) và B yếu (weak-B) (ví dụ, B3, Bint,...). Vì chúng gây ra sự ngưng kết yếu trong phân loại hồng cầu, thậm chí mẫu máu kiểm tra có thể bị phân loại sai như nhóm O.
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Trong số nhiều phương pháp phân loại máu, một phương pháp đĩa (plate method), một phương pháp thẻ gel (gel card method), và một hệ thống kiểm tra ngân hàng máu tự động (automated blood bank test system) được coi như những phương pháp phân loại máu điển hình nhất. Phương pháp đĩa thì khá đơn giản nhưng thiếu hấp dẫn do toàn bộ quy trình là thủ công. Hơn nữa, nó có thể dẫn đến sự phân loại nhóm máu sai không mong muốn của một mẫu máu do độ tin cậy kém và hiệu suất người sử dụng ít. Phương pháp thẻ gel được xem làphương pháp bán tự động và kiểm tra khá chính xác. Tuy nhiên, bộ kit kiểm tra thì đắt, đòi hỏi một phần thao tác tay và cần có thiết bị phụ, như máy ly tâm. Hệ thống ngân hàng máu phân loại nhiều loại máu hoàn toàn tự động. Tuy nhiên, hệ thống này rất đắt và đồ sộ nên chỉ những trung tâm y khoa chính hay những ngân hàng máu mới có thể duy trì nó.
Năm 2005, Lee et al.[35] trình bày một hệ thống phân loại máu thu nhỏ được chế