Mẫu dò ” cDNA hay oligonucleotide ” được gắn lên bề mặt array bằng một trong hai cách: (1) cố định những cDNA hay oligonucleotide đã được tổng hợp trước đó lên bề mặt chất nền bằng cả liên kết đồng hóa trị và không đồng hóa trị, và (2) tổng hợp tại chỗ các oligonucleotide trên chất nền. Nhiều kỹ thuật cố định hiện đang tồn tại, bao gồm in lắng đọng tiếp xúc đỉnh (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing ” μCP), hệ thống vi lưu (micro-fluidics networks ” μFN). In áp điện có thể sử dụng cho cả trường hợp cố định và tổng hợp tại chỗ. Riêng kỹ thuật quang khắc chỉ sử dụng cho trường hợp tổng hợp tại chỗ [36].
2.3.2.1. In lắng đọng tiếp xúc đỉnh (contact-tip deposition printing)
Kỹ thuật này được thương mại hóa vào năm 1997 bởi công ty Synteni (Fremont, California, USA; bây giờ là Incyte Genomics, Inc., Palo Alto, California, USA), được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để sản xuất ra những DNA array cho riêng họ. Đầu tiên, acid
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
nucleic dùng cố định được hòa tan trong dung môi thích hợp. Một cây kim với đầu tip hình nón xẻ rãnh được nhúng vào trong dung dịch này nhằm rút đi một lượng xác định dung dịch vào trong rãnh đó, sau đó dung dịch này được đặt lên bề mặt chất nền (hình 2.26). Để những đầu tip hoạt động tốt thì cần làm sạch thường xuyên và thay thế. Trong thực tế, vài cây kim được sử dụng đồng thời, những đường rãnh ở đầu tip có vai trò như một nơi chứa dung dịch. Tóm lại, cấu tạo của nó cũng giống như một cây viết mực thông thường.
Hình 2.26. Chế tạo DNA microarray bằng kỹ thuật in lắng đọng tiếp xúc đỉnh [36].
Kỹ thuật này có một nhược điểm là những điểm (spot) tạo thành thường có một tâm rỗng, có thể là do đầu nhọn của kim đã lấy đi một vài phân tử liên kết được phủ lên bề mặt chất nền.
Hình 2.27. Những đầu tip dùng trong in lắng đọng tiếp xúc đỉnh [36].
In lắng đọng tiếp xúc đỉnhcó thể sử dụng để sản xuất những array mật độ cao. Ví dụ, Incyte Genomics và Synteni đã sản xuất những array chứa khoảng 10 000 cDNA khác nhau xếp loại kích cỡ từ 500 đến 5000 bases trên một bề mặt thủy tinh khoảng 3,6 centimet vuông.
Năm 1998, công ty Genetic Microsystems (Woburn, Massachusetts, USA; ngày nay là Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA) đã giới thiệu một biến thể của kỹ thuật này được gọi là hệ thống ‚pin-and-ring array‛. Một vòng nhỏ đường kính khoảng vài milimet
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
được nhúng vào dung dịch acid nucleic. Khi đó, một lớp màng mỏng được tạo thành trong vòng bởi sức căng bề mặt ” giống như khi thổi bong bóng xà phòng. Cái vòng được đặt phía trên mảng và một cây kim chóp cụt nhẵn được lồng xuyên qua màng mỏng đến khi tiếp xúc với bề mặt mảng. Bằng cách này, một phần xác định của màng mỏng sẽ bám chặt vào đỉnh của cây kim và được lắng đọng lên bề mặt mảng (hình 2.28). Vài điểm có thể được tạo thành trước khi vòng được nạp lại.
Hình 2.28. Chế tạo DNA array sử dụng kỹ thuật pin-and-ring array [36].
2.3.2.2. In vi tiếp xúc ( Micro-contact printing_ μCP)
Phương pháp in vi tiếp xúc hoạt động với cách thức tương tự như in lắng đọng tiếp xúc đỉnh. Trong μCP, một con dấu PDMS được sử dụng để chuyển những acid nucleic lên bề mặt mảng (hình 2.29). Ưu điểm của vật liệu này là nó có thể được sử dụng để sản xuất những cấu trúc rất nhỏ và hiện nay cũng đã chế tạo được những con dấu dùng sản xuất những cấu trúc xác định nhỏ hơn 50 nm. Tuy nhiên, những kết quả thực tế thu được từ phương pháp này đang gây thất vọng. μCP chỉ được sử dụng để cố định những kháng thể lên chất nền bằng vàng, kỹ thuật này chưa thành công trong sản xuất array với mật độ mẫu dò cao, những yêu cầu thường gặp trong sản xuất DNA array [36].
Hình 2.29. Chế tạo DNA array sử dụng kĩ thuật in vi tiếp xúc [36].
2.3.2.3. Hệ thống vi lưu (Micro-fluidics network _μFN)
Kỹ thuật hệ thống vi lưu là sự phát triển xa hơn nữa của kỹ thuật μCP. Trong μFN, một con dấu PDMS chứa những rãnh nhỏ được đặt trên bề mặt thủy tinh, vàng, polystyrene hay silic dioxit. Những rãnh nhỏ này được lấp đầy bằng dung dịch chứa DNA, sau đó được chuyển lên bề mặt của array bằng sức hút mao dẫn (hình 2.30).
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Trong kỹ thuật này, sự hút giữ của mao quản có thể xảy ra và vì vậy lượng dung môi thích hợp phân phối trên mảng sẽ bị hạn chế. Cũng giống như kỹ thuật μCP, tính khả thi của μFN để sản xuất những mảng DNA vẫn chưa được chứng minh [36].
Hình 2.30. Chế tạo array sử dụng kỹ thuật hệ thống vi lưu [36].
2.3.2.4. In áp điện
Những thiết bị in áp điện sử dụng kỹ thuật của máy in mực thông thường để phân phối những lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì là mực (hình 2.31).
Hình 2.31. Nguyên tắc của phương pháp in áp điện [36].
Quá trình phân phối được thực hiện bằng cách sử dụng những đầu pipet silicon và thủy tinh đường kính nhỏ hơn 100μm, dung tích trong khoảng giữa 15 picolit (15 x 10-12 lit) và 500 picolit, được áp vào một tần số trên 2 kHz và một hệ số biến thiên nhỏ hơn 1%. Thể tích giọt lỏng có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi điện áp và bề rộng xung điện cũng như tần số và số lượng xung [36]. Kỹ thuật in áp điện đã được sử dụng để sản xuất những microarray với trên 10 000 điểm (spot) trên một centimet vuông. Những hệ thống áp điện có giá trị thương mại hiện nay cho phép sản xuất những array với đường kính điểm khoảng 200μm, khoảng cách tâm của 2 điểm là 300 μm, và mật độ hơn 1400 điểm trên một centimet vuông. Ngoài ra kích thước điểm có thể được giảm xuống còn 25 đến 30μm. Những hệ thống phân phối áp điện có khả năng thực hiện sự phân phối với một độ chính xác ấn tượng (hình 2.33).
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình 2.32. Sự hình thành giọt lỏng tại đầu
tip của thiết bị phân phối áp điện [36]. Hình 2.33. Độ chính xác của vòi phun
áp điện. (phân phối giọt lỏng xuyên qua mắt của cây kim) [36].
Trong kỹ thuật in áp điện, khi phân phối các giọt lỏng thường xảy ra sự bắn tung tóe dẫn đến sự nhiễm giữa các chấm (spot) và sự bay hơi của những dung tích nhỏ mẫu dò là điều thường xảy ra [36]. Những yếu tố này làm giảm phẩm chất của array vì vậy nhiều nỗ lực đang được thực hiện để phát triển những bề mặt với mức độ thấm ướt nhất định. Ví dụ, công ty Protogene (Palo Alto, California, USA) đã sử dụng những chất nền có bề mặt thấm ướt phân tách bằng những hàng rào kị nước. Sự bốc hơi của dung tích nhỏ mẫu dò được giải quyết bằng cách sử dụng đệm polyacrylamide. Gel polyacrylamide vừa có sức chứa acid nucleic cao vừa giảm được vấn đề bốc hơi.
Trong quá trình thực hiện, sự tiếp xúc của vòi phun với bề mặt chất nền nên được ngăn ngừa vìø điều này có thể làm giảm sự rung động, gây ra sự gắn không chính xác của mẫu dò và làm hỏng cả chất nền hay chóp phun [36]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình 2.34. Tổng hợp oligonucleotide tại chỗ sử dụng hệ thống phân phối áp điện [36]. A) Phương pháp một vòi phun. B) Phương pháp nhiều vòi phun.
Những từ viết tắt được sử dụng trong hình: DMTr, dimethoxytrityl protecting group; DTR, de-tritylation reagent.
Trong tổng hợp oligonucleotide tại chỗ, những vòi phun chuyên dụng mức độ cao được sử dụng. Hai chiến lược có thể được sử dụng để giải quyết vấn đề này, cả hai đều tận dụng phương pháp phosphoramidite được cải biến để tổng hợp những oligonucleotide. Trong hệ thống đơn vòi, một vòi phân phối riêng lẻ được sử dụng để gắn một chất phản ứng, chất mà khử bảo vệ nhóm 5’-hydroxyl của những dẫn xuất nucleotide tại những vị trí xác định trên chất nền. Sau đó thêm những nucleotide được bảo vệ, sự bắt cặp của một nucleotide với nhóm hydroxyl không được bảo vệ trên chất nền và sau đó sự oxy hóa photpho được hoàn tất bằng cách làm ẩm hoàn toàn bề mặt chất nền với chất phản ứng thích hợp. Trong hệ thống nhiều vòi, 5 vòi phân phối khác nhau được sử dụng, mỗi cái chứa một trong 4 phosphoramidite nucleotides cần thiết cho tổng hợp oligonucleotide. Vòi thứ 5 dùng phân phối chất phản ứng de-tritylation.
2.3.2.5. Quang khắc sử dụng mặt nạ crom/thủy tinh
Affymetrix, Inc. (Santa Clara, California, USA) đã phát triển một phương pháp quang khắc để tổng hợp oligonucleotide tại chỗ. Chu trình này dựa trên những kỹ thuật có nguồn gốc từ công nghiệp bán dẫn. Thủy tinh phủ một lớp bảo vệ nhạy quang được sử dụng như một chất nền (hình 2.35). Bằng cách sử dụng một mặt nạ, những diện tích xác định trên bề mặt được hoạt hóa bằng tia cực tím, gây ra sự loại trừ những nhóm bảo vệ nhạy quang. Bề mặt sau đó được ủ với những nucleotide được bảo vệ, nucleotide sẽ phản ứng với những nhóm hydroxyl tự do tại bề mặt của những vùng được hoạt hóa này. Tiếp tục sử dụng một mặt nạ thứ hai, những vùng khác được hoạt hóa sau đó phản ứng với những nucleotide khác. Những nucleotide liên kết với bề mặt mang những nhóm bảo vệ kết hợp ở vị trí 3’ của ribose subunit, và như vậy chỉ có thể liên kết với những nucleotide khác sau khi nhóm bảo vệ được khử bằng sự quang hóa. Bằng cách lặp lại chu trình quang
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
hóa ở những vị trí mục tiêu và ủ với những nucleotide được bảo vệ, một mảng chứa đầy những oligonucleotide xác định được tạo ra trên chất nền [36].
Để tổng hợp những mẫu dò có chiều dài 25 base trên một array hoàn chỉnh, trên 80 chu trình tổng hợp với hơn 80 mặt nạ crom/thủy tinh khác nhau được cần đến. Những mặt nạ đắt tiền này chỉ có thể sử dụng một lần.
Hình 2.35. Chế tạo quang khắc dùng nhóm bảo vệ nhạy quang và mặt nạ quang khắc [36].
Số bước tổng hợp trong sản xuất array không phụ thuộc vào số lượng mẫu dò mà chỉ phụ thuộc vào chiều dài mẫu dò. Một mẫu dò có chiều dài n sẽ cần tối đa 4 x n bước tổng hợp. Chiều dài thông thường của những oligonucleotide được tổng hợp bằng phương pháp này là 20 ” 25 base. Hiện nay, với nhiều nỗ lực, chiều dài này đã được tăng lên đáng kể.
2.3.2.6. Quang khắc sử dụng những vi gương
Gần đây, những nhà nghiên cứu tại đại học Wisconsin đã trình bày một kỹ thuật quang khắc có thể tránh được việc sử dụng những mặt nạ crom/thủy tinh đắt tiền. Sử dụng những chùm tia của thiết bị điện tử tương tự như kỹ thuật vô tuyến truyền hình, những nhà nghiên cứu sản xuất một cái gọi là ‘virtuous mask’ chứa trên 480 000 vi gương với chiều dài cạnh là 16mm. Bằng việc thay đổi góc nghiêng, những gương này có khả năng định vị chính xác những đốm sáng UV rõ ràng trên bề mặt của một array (hình 2.36). Theo cách đó, những vùng riêng biệt sẽ được khử nhóm bảo vệ và cho phép một chuỗi oligonucleotide được tổng hợp như trong kỹ thuật quang khắc thông thường. Hệ thống này có khả năng thực hiện một array khoảng một centimet vuông có khả năng giám sát biểu hiện của 50000 gen khác nhau. Hơn nữa, dựa trên những nhân tố giới hạn của bước sóng tia tử ngoại, có khả năng trong tương lai sẽ giảm chiều dài cạnh của hệ thống chiếu đến 0,35mm [36].
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
Hình 2.36. Sự chế tạo bằng phương pháp quang khắc với vi gương [36].