Mối quan tâm chủ yếu khi bắt đầu sản xuất protein array là làm thế nào để giám sát quá trình liên kết. Không có phương pháp đánh dấu huỳnh quang tương tự như tổng hợp cDNA để đánh dấu protein, mặc dầu thuốc nhuộm phát huỳnh quang có thể được thêm vào
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
bằng phương pháp hóa học. Nếu mẫu protein được sử dụng là một hỗn hợp phức tạp như những mẫu chẩn đoán điển hình, protein sẽ hiện diện ở những mức độ khác nhau. Trong trường hợp này, những protein có số lượng bản sao thấp có thể không được đánh dấu phát hiện thích hợp. Do đó, hệ thống phát hiện được sử dụng cần phải đảm bảo là đáng tin cậy cho những nghiên cứu trên array.
Nhìn chung, protein có thể được đánh dấu bằng phương pháp hóa học, chất đồng vị phóng xạ hay bằng sự hợp nhất với một protein phát huỳnh quang. Những kỹ thuật không cần đánh dấu khác cũng tồn tại, với những kỹ thuật này không cần cải biến protein [30].
2.4.4.1. Đánh dấu hóa học
Những thuốc nhuộm phát huỳnh quang có thể sử dụng như N-Hydroxy Succinimide ester (NHS ester) kết hợp với những nhóm amino, hay những maleimide để phản ứng với những nhóm sulfhydryl tự do. Chất nhuộm thứ hai thì thích hợp để đánh dấu những kháng thể vì những phân tử phát huỳnh quang được giới thiệu thì cách xa khỏi vị trí liên kết của kháng thể. Để đạt được độ nhạy vừa đủ, tỷ lệ phân tử gam của thuốc nhuộm và protein cần thiết phải là 5:1 [30]. Tuy nhiên, để kiểm soát sự sáp nhập của chất đánh dấu vào protein thì khó hơn với acid nucleic do tính không đồng nhất hóa học. Do đó, khi đánh dấu một mẫu phức tạp cũng nên dự đoán trước trường hợp vài loại protein sẽ không được đánh dấu trong khi những protein khác thì bị đánh dấu quá mức. Khi phân tích kết quả dữ liệu, cần phải cân nhắc sự thật là sự đánh dấu hóa học có thể làm xáo trộn vị trí liên kết của protein.
2.4.4.2. Đánh dấu phóng xạ
Trong một vài ứng dụng, mẫu dò protein có thể phải đánh dấu phóng xạ. Ge [21] đã sử dụng protein tái tổ hợp p52 tái tổ hợp của người được đánh dấu với [γ-32P]ATP trong sự hiện diện của kinase cơ tim. Những array sau đó có thể được quan sát với độ nhạy cao bằng cách sử dụng một màng photpho. Để đạt được kết quả tốt nhất, những array nên được tạo thành bằng cách sử dụng những chấm có đường kính lớn (> 300 µm).
2.4.4.3. Protein hợp nhất phát huỳnh quang
Để tránh nhu cầu đánh dấu thêm những protein mẫu dò, Kukar et al. đã trình bày phương pháp hợp nhất protein tái tổ hợp với những protein phát huỳnh quang xanh (GFP) và đỏ (RFP) [34]. Nhóm này đã chứng minh rằng một lượng ít như 15pg RFP có thể được phát hiện. Kỹ thuật này đặc biệt thích hợp cho những array chức năng vì GFP có thể được sử dụng để giám sát sự gấp nếp của những protein quan tâm. Những protein hòa tan hợp nhất với GFP gấp nếp tốt sẽ hiện ra sáng hơn những protein tương đương không hòa tan gấp nếp kém [46].
Chương 2: Đại cương kỹ thuật và ứng dụng của Biochip
2.4.4.4. Nghiên cứu sandwich
Phương pháp phát hiện sandwich được sử dụng từ lâu trong nghiên cứu miễn dịch chẳng hạn như ELISA. Về cơ bản, một kháng thể được cố định bắt giữ kháng nguyên mục tiêu, và sau đó một kháng thể phát hiện thứ hai được sử dụng để chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên trên mảng. Giá trị của nghiên cứu sandwich trong microarray kháng thể là không yêu cầu kháng nguyên đích được đánh dấu, vì vậy tin chắc rằng kết quả đạt được là chính xác. Hơn nữa, tín hiệu chỉ được ghi nhận nếu hai liên kết độc lập xảy ra, nghĩa là, kháng thể được cố định ” kháng nguyên, và sau đó kháng thể phát hiện ” kháng nguyên. Mặt trái của điều này là 2 ligand không cạnh tranh phải có sẵn cho mỗi protein, vì vậy cần có những thử nghiệm sàng lọc từ đầu. Sự thông qua sớm của những nghiên cứu sandwich nghĩa là đã có sự hiểu biết đáng kể về những kháng thể có tính đặc hiệu và ái lực tốt với những protein riêng biệt. Phương pháp sandwich có thể chứng minh tính hữu dụng đặc biệt khi phát hiện những biến đổi sau quá trình dịch mã [30].
Kháng thể phát hiện thứ cấp của những nghiên cứu sandwich có thể được đánh dấu phát huỳnh quang hoặc kết hợp với enzyme, chẳng hạn như peroxidase. Gần đây, những tác nhân phát quang bằng phản ứng hóa học có giá trị có thể được sử dụng để phát hiện ở mức pictogram thấp đến trung bình. Điều này đặc biệt quan trọng để phát hiện những protein ở mức thấp chẳng hạn như hormone và cytokine [30].