Để có thêm cơ sở thể lý giải vì sao băng protein tái tổ hợp thu được có KLPT không phù hợp với tính toán lý thuyết, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch protein này bằng
sắc ký qua cột ái lực hisbind. Cụ thể, chúng tôi đã siêu âm phá vỡ màng tế bào, sau đó loại bỏ dịch nổi và thu tủa tế bào. Kết tủa được rửa bằng đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa Triton X-100 1%, ure 1 M kết hợp lắc nhẹ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm để loại bỏ dịch nổi. Bước này được thực hiện lặp lại 2 lần nhằm loại bỏ phần lớn protein không mong muốn khác.
Protein tái tổ hợp trong kết tủa được hòa tan trong đệm Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, ure 8 M, imidazol 5 mM (đệm A), sau đó được cho lên cột hisbind đã được cân bằng với đệm A. Protein gắn trên cột được rửa chiết bằng đệm A có chứa imidazol 250 mM. Các phân đoạn không hấp thụ trên cột và phân đoạn protein được rửa chiết ra bằng imidazol 250 mM được kiểm tra về độ tinh sạch bằng điện di protein trên gel SDS-PAGE 15% và thẩm tách miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1.
Kết quả điện di protein được thể hiện ở hình 17 cho thấy phân đoạn không hấp thụ trên cột có chứa một số băng protein khác nhau (hình 17, đường chạy 2), phân đoạn rửa chiết bằng imidazol gần như chỉ có một băng protein khoảng 19 kDa (hình 17, đường chạy 1), chứng tỏ protein này đã được tinh sạch.
Kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (hình 18) cho thấy kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 không nhận biết băng protein 19 kDa trong dịch hòa tan kết tủa của tế bào cũng như băng protein tái tổ hợp đã được tinh sạch. Chúng tôi cũng đã thử khả năng phân cắt cơ chất đặc hiệu của chế phẩm protein tái tổ hợp thu được, tuy nhiên kết qủa cho thấy protein thu được là không có hoạt tính. Kết quả khẳng định rằng protein mà chúng tôi thu được không phải là protease HIV-1 hoặc chỉ chứa một phần nhỏ của protein nên không thể hiện tính kháng nguyên cũng như hoạt tính xúc tác của protease HIV-1.
Tóm lại, chúng tôi đã phát hiện được một đột biến kháng nhẹ thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 phân lập từ một bệnh nhân Việt Nam đang điều trị bằng thuốc kháng virus và đã bước đầu đưa được gen này vào hệ thống vector biểu hiện pET32a dưới dạng dung hợp với gen mã hóa cho thioredoxin cùng với trình tự nhận
biết và phân cắt của protease HIV-1. Tuy vậy chúng tôi chưa thành công trong việc biểu hiện được gen mã hóa protease HIV-1 để tạo ra một protein có hoạt tính..
Hình 17: Điện di protein kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột His-bind
Đường chạy 1. Phân đoạn rửa chiết cột His-bind bằng imidazil 250 mM Đường chạy 2. Phân đoạn không gắn cột His-bind
Đường chạy 3. Protein tổng số trong tủa tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA
Hình 18: Kết quả thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột His-bind
Đường chạy 1. Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
Đường chạy 2. Protein tổng số trong tủa tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA
Đường chạy 3. Protease HIV-1 (Đối chứng dương) Đường chạy 4. Phân đoạn không gắn cột His-bind
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã nhân bản, nhân dòng và xác định được trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 thu nhận tại Việt Nam và phát hiện được một đột biến thay thế nucleotide A bằng C ở vị trí 248 (A248C), dẫn đến sự thay thế asparagine (N) ở trí 83 bằng threonine (T) trong protein. Đột biến này được xác nhận là có tính kháng nhẹ thuốc ức chế protease.
2. Đã đưa được gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vào vector biểu hiện pET32a dạng dung hợp với thioredoxin cùng với trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1 và biến nạp được vào tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL. Protein biểu hiện từ tế bào mang vector tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 19 kDa, được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực hisbind nhưng không được nhận biết bởi kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 cũng như không có hoạt tính phân cắt cơ chất đặc hiệu của enzyme.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu một cách có hệ thống trên diện rộng gen mã hóa protease HIV để phát hiện các đột biến kháng PI mới phục vụ công tác điều trị và nghiên cứu.
2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T và các đột biến kháng PI khác để tìm hiểu các đặc trưng xúc tác cũng như ảnh hưởng của các thuốc ức chế protease lên hoạt độ của chúng, góp phần làm sáng tỏ tính chất kháng thuốc trong điều trị bệnh AIDS.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học cơ sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Vân
Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dòng và bước đầu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr. 227-233.
3. Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Trang Huyền, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2011), “Một số đột biến trong gen mã hóa protease HIV type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ (ĐHQGHN) (đang in).
Tài liệu tiếng Anh
4. Alastair, J. J., Wood, M. D. (1998), “HIV protease inhibitors”, Engl. J. Med,
338, pp. 1281-1292.
5. Chen, H., Xu, Z., Yin, X., Cen, P. (2007), “Cloning and expression of the HIV protein in Escherichia coli cell-free system”, Appl. Micrbiol. Biotechnol, 77, pp. 347–354.
6. Cheng, Y. S. E, McGowan, M. H, Kettner C. A, Schloss, J. V., Erickson, S., Yin F. H. (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzyme from inclusion bodies”, Gene, 87, pp. 243-248.
7. Daar, E. S., Little, S., Pitt, J., Santagelo, J., Ho, P., Harawa, N., Kemdt, P., Giogi, J. V., Bai, J., Gaut, P., Richman, D. A., Mandel, S., Nicholas, S. (2001), “Diagnosis of primary HIV-1 infection”, Ann. Int. Med, 134, pp. 25-29.
8. Darke, P. L., Leu, C. T., Davis, L. J., Heimbach, J. C., Diehl, R.E., Hill, W. S., Dixon, R. A.., Sigal, I. S. (1989), “Human immunodeficiency virus protease: bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J.
Biol. Chem, 264, pp. 2307-2312.
9. Debouck, C., Gorniak, J. G., Strickler, J. E., Meek, T. D., Metcalf B. W., Rosenberg, M. (1987), “Human immunodeficiency virus protease expressed in
Escherichia coli exhibit autoprocessing and specific maturation of the gag
10. Dergousova, N. L., Amerik, A. Y., Volynskaya, A. M., Rumsh, A. D. (1996), “HIV-1 protease cloning, expression, and purification”, Appl. Biochem.
Biotechnol, 61, pp. 97-108.
11. Francessca, C., Gago, F., Bertoli, A., Forbici, F. (2004), “Identification of the minimal conserved structure of HIV-1 protease in the presence and absence of drug pressure”, AIDS, 12, pp. 9-11.
12. Geoghegan, K. F., Spender, R. W., Danley, D. E., Contillo, L. G., Andrews, G. C., (1990), “Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiencyl virus HIV-1”, FEBS Lett, 262(1), pp. 119-122. 13. Graves, M. C., Lim J. J., Heimer, E. P. (1988) “An 11-kDa form of human
immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli is sufficient for enzymatic activity”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 2449-2453.
14. Hare, B. C. (2006), “Clinical overview of HIV”, HIV Insite Knowledge Base
Chapter. Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu.
15. Hoffman, C., Rockstroh, J., Kamps, B. S., HIV Medicine (2006) from www. HIVMedicine.com.
16. Ishizaki, A., Cuong, N. H., Thuc, P. V., Trung, N. V., Saijoh, K., Kageyama, S., Ishigaki, K., Tanuma, J., Oka, S., Ichimura, H. (2009), “Profile of HIV type 1 infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment-naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”,
AIDS Res. Hum. Retrovir., 25, pp. 175-182.
17. Janeway, C. (2001), Immunobiology, GarlandScience, USA.
18. Komai, T., Ishikawa, Y., Yagi, R., Suzuki-Sunagawa, H., Nishigaki ,T., Handa, H. (1997), “Development of HIV-1 protease expression methods using the T7 phage promoter system”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, pp. 241-245.
19. Krauslicht, H. G., Ingrahams, R. H., Skoog, M. T.,Wimmert, E., Pallait, P. V., Cartert, C. A. (1989), “Activity of purified biosynthetic proteinase of human immunodeficiency virus on natural substrates and synthetic peptides”, Proc.
20. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature.227, pp: 680-685.
21. Lan, N. T., Recordon-Pinson, P., Hung, P. V., Uyen, N. T., Lien, T. T. (2003), “HIV type 1 isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 study, Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs”, AIDS Res.
Hum. Retrovir., 19, pp. 925–928.
22. Lech, W. J., Wang, G., Yang, Y. L., Chee, Y., Dorman, K., McCrae, D., Lazzeroni, L. C., Erickson, J.W., Sinsheimer, J. S., Kaplan, A. H. (1996), “In vivo sequence diversity of the protease of human immunodeficiency virus type 1: presence of protease inhibitor-resistant variants in untreated subjects”, J. Virol., 70, pp. 2038–2043.
23. Leuthardt, A., Roesel, J. L. (1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-histidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 326 (1, 2,3), pp. 275-280.
24. Louis, J. M., Mcdonald, R. A., Nashed, N. T., Wondraku, E. M., Jerina, D. M., Oroszilan S., Mora, P. T. (1991), “Autoprocessing of the HIV-1 protease using purified wild-type and mutated fusion proteins expressed at hing level in
Escherichia coli”, Eur. J. Biochem., 199, pp. 361-369
25. Louis, J. M., Nashed, N. T., Parris, K. D., Kimmel, A. R., Jerina D. M. (1994), “Kinetics and mechanism of autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease from an analog of the Gag-pol protein”, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91, pp. 7970- 7974.
26. Nashed, N. T., Louis, J. M., Sayer, J. M., Wondrak, E. M., Mora, P. T., Oroszlan, S., Jerina, D. M. (1989), “Continuos spectrophotometric assay for retroviral protease of HIV-1 and AMV”, Biochem. Biophys. Research.
Commun., 163(2), pp. 1079-1085.
27. Navia, M. A., Fitzgerald, P. M., McKeever, B. M., Leu, C.T., Heimback, J. C., Herber W. K., Sig, I. S., Darke P.L., Springer J. P. (1989), “Three-dimensional structure of aspartyl protease from human immunodefiency virus HIV-1”,
28. Nijhuis, M., Maarseveen, N. M., Lastere, S., Schipper, P., Coakley, E., Glass, B. (2007), “A novel substrate-based HIV-1 protease inhibitor drug resistance mechanism”, Plos. Med., pp. 152-163.
29. Nutt, R. F., Brady, S. F., Darke, P. L., Ciccarone, T. M., Nutt, E. M., Rodkey, J. A., Bennett, C.D., Waxman, L. H., Sigal, I. S., Anderson, P. S., Veber D. F. (1988), “Chemical synthesis and enzymatic activity of a 99-residue peptide with a sequence proposed for the human immunodeficiency virus protease”,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 7129-7133.
30. Rao, M., Tanksale, A., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. (1998), “Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases”, Microbiol. Mol. Biol.
Rev., 62, pp. 600-601.
31. Richards, A. D., Phylip, L.H., Farmerie, W. G., Scarborough, P. E., Alvares, A., Dunn, B. M., Hirel, H., Konvalinka, J., Strop, P., Pavlickova, L., Kostla, J., Kay V. (1990), “Sensitive, soluble chromogenic substrates for HIV-1 Proteinase”, J. Biol. Chem. USA, 265 (14), pp. 7733-7736.
32. Rangwala, S. H., Finn, R. F., Smith, C.E., Berberich, S. A., Salsgiver, W. J., Stallings, W. C., Glover, G. I., Olins, P. O. (1992), “High-level production of active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gene, 122, pp. 263-269.
33. Sambrook, J., Russell, D. W. (2000), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 15-22.
34. Shedlock, D. J., Daniel H., Andy, Y. C., Christopher, W. C., Karuppiah, M., David, B. W. (2008), Apoptosis, Spingerlink, USA.
35. Taylor, A., Brown, P. D., Kadam, S., Maus, M., Kohlbrenner, E. W., Weigl, D., Turon, C. M., and Katz, L. (1992), “High-level expression and purification of mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD
promoter”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, pp. 205-210. 36. UNAIDS in Vietnam, from www.unaids.org.vn.
37. United nations program on HIV/AIDS, UNAIDS/WHO AIDS, Epidemic
38. Wan, M., Takagi, M., Loh, N. B., Xu, X. Z., Imanaka T. (1996), “Autoprocessing: an essential step for the activation of HIV-1 protease”,
Biochem. J., 316, pp. 569-573.
39. Yunfeng, T. (2006), “Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease and drug-resistant mutants”, pp. 25-34. Chemistry Dissertations.
Paper 2 (from http://digitalarchive.gsu.edu/chemistry_diss/2) 40. http://www.aids-india.org/hivbasics2.htm
41. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU518273