khuẩn E. coli BL21 (DE3) RIL
Để biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1, plasmid tái tổ hợp pET32-ProtHA sau khi được đưa vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α được tinh sạch và biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL. Một khuẩn lạc của tế bào E. coli chủng BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA được nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB lỏng. Tế bào được trẻ hóa trong 150 ml LB lỏng và được nuôi cấy cho đến khi mật độ tế bào A đạt đến khoảng 0,7, tiến hành cảm ứng bằng IPTG 0,1 mM. Sau
3h nuôi cấy, tế bào được ly tâm để loại bỏ dịch nuôi cấy và siêu âm để thu dịch chiết trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa NaCl 100 mM, PMSF 1mM. Tương tự, protein tổng số trong phân đoạn kết tủa cũng được thu nhận bằng cách hòa tủa tế bào trong đệm Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có ure 8 M. Protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và phân đoạn tủa tế bào sau đó được điện di trên gel SDS- PAGE 15% và thẩm tách miễn dịch với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1. Kết quả điện di protein tổng số ở hình 16 cho thấy phân đoạn tủa (đường chạy 1) và dịch chiết (đường chạy 2) của tế bào E. coli BL21 (DE3) mang pET32a-ProtHA được cảm ứng bởi IPTG đều xuất hiện băng kích thước khoảng 19 kDa, trong khi mẫu không cảm ứng không có băng protein này (đường chạy 3 và 4). Kết quả điện di cũng còn cho thấy protein tái tổ hợp có mặt trong phân đoạn kết tủa nhiều hơn trong dịch chiết. Tuy vậy, băng protein tái tổ hợp 19 kDa là không tương đương với KLPT của protease HIV-1 tái tổ hợp dạng dung hợp gắn với thioredoxin (KLPT tổng cộng là 31 kDa) hay dạng tự cắt khỏi thioredoxin (12 kDa).
Hình 16: Kết quả điện di protein tổng số có chứa protease HIV-1 tái tổ hợp mang đột biến N83T trong phân đoạn dịch chiết và tủa tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL
Đường chạy 1: Phân đoạn tủa tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA cảm ứng bởi IPTG 0,1 mM
Đường chạy 2: Dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA cảm ứng bởi IPTG 0,1 mM.
Đường chạy 3, 4: Phân đoạn tủa và dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-ProtHA không cảm ứng bởi IPTG.
Đường chạy 5; 6: Phân đoạn tủa và dịch chiết tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32-Prot cảm ứng bởi IPTG 0,1 mM (đối chứng dương).
Đường chạy 7: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn.
Đường chạy 8: Phân đoạn tủa tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL mang pET32a nguyên bản cảm ứng IPTG 0,1 mM (đối chứng âm).