Nguyên tắc: các protein chứa trình tự Histidine (His-tag) có ái lực cao với ion
Ni2+. Do vậy, những protein này có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên gel His- bind (có giá thể được gắn thêm gốc Ni2+), sau đó protein đích gắn trên cột được thu lại bằng cách rửa chiết protein ra khỏi gel với Imidazol, là chất có cấu tạo tương tự His.
Tiến hành: Gel His-bind ở dạng trương nở sẵn được nhồi vào cột (kích thước 1x2 cm) để có thể tích cột gel 2 ml. Cột gel được xử lý Ni2+ nồng độ 50 mM để tạo phức hệ gắn; sau đó được cân bằng với đệm A (Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa NaCl 100 mM, ure 8 M, và Imidazol 5 mM). Phân đoạn kết tủa tế bào chứa protease HIV-1 được cho lên cột với tốc độ 10 ml/giờ. Các protein không gắn với gel được loại bỏ dần bằng cách rửa cột với đệm A có Imidazol 20 mM đến khi OD280‹ 0,1.
2.2.9. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phƣơng pháp của Laemmli [20]
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 15% với tỷ lệ thành phần được ghi ở bảng 4.
Bảng 4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide
Thành phần Gel tách 15% Gel cô 4%
Dung dịch acrylamide 30% 1,97 ml 0,16 ml 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 0,94 ml 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 0,31 ml Nước cất 0,94 ml 0,76 ml APS 10% 30 l 20 l TEMED 7 l 5 l
Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp được trộn đều đúc vào khuôn kính đã được gắn sẵn trên giá đỡ. Gel tách được đúc trước, bề mặt gel được phủ một lớp butanol tuyệt đối để mặt gel phẳng. Sau khi phần gel tách được trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và cài lược để tạo các Đường chạy, để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein được trộn vào đệm mẫu (nồng độ 4X gồm Tris-HCl, glycerol, SDS, β-mercaptoethanol, bromophenol blue) theo tỷ lệ thể tích 3:1, xử lý nhiệt ở 950C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trên đá và dùng để tra Đường chạy chạy điện di.
Đệm chạy điện di là Tris-Glycine pH 8,8 có chứa SDS 1%, quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) chạm mép bản gel thì dừng lại.
Gel được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol: axit axetic: H2O với tỷ lệ thể tích là 3: 6: 1 trong khoảng 20 phút, màu thuốc nhuộm được tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.