bào E. coli chủng DH5
Tiếp theo, sản phẩm PCR ở bước thí nghiệm trước được nhân dòng vào vector pGEM-T theo kit của hãng Promega. Phản ứng gắn giữa sản phẩm PCR và vector pGEM-T được thực hiện để tạo vector pGEM- T tái tổ hợp mang đoạn gen mã hoá protease HIV-1 mong muốn. Sản phẩm này sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp được nhân lên với số lượng lớn.
Kết quả biến nạp (hình 9) cho thấy, chúng tôi đã thu nhận được hầu hết các khuẩn lạc trắng và một số khuẩn lạc xanh trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 50 g/ml, cơ chất X-gal và IPTG làm chất cảm ứng.
Theo lý thuyết, các khuẩn lạc E. coli màu trắng sẽ chứa plasmid tái tổ hợp, trong khi đó các khuẩn lạc xanh mang plasmid tự đóng vòng, không chứa gen ngoại lai. Kết quả này cho phép chúng tôi bước đầu kết luận là đã thu nhận được khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1.
Hình 9: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR (đoạn gen mã hóa protease HIV-1) và vector pGEM-T Easy vào E. coli chủng DH5α
Từ các khuẩn lạc thu được, một số khuẩn lạc trắng được chọn ngẫu nhiên để tiến hành tinh sạch plasmid. Để kiểm tra plasmid đã tinh sạch có chứa đoạn gen mã hoá protease HIV-1 hay không chúng tôi đã sử dụng plasmid này làm khuôn và tiến hành PCR sử dụng cặp mồi pGEM-T Fw/Rv (cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide ở hai đầu của trình tự vùng nhân dòng đa điểm cắt của vector pGEM-T). Theo tính toán, nếu chúng tôi nhân dòng không thành công thì khi PCR dùng cặp mồi pGEM-T Fw/Rv sẽ nhân lên được đoạn DNA có kích thước khoảng 0,3 kb còn trong trường hợp nhân dòng thành công thì PCR sẽ nhân được đoạn DNA có kích thước 0,64 kb bao gồm kích thước 0,34 kb của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 gắn vào và 0,3 kb của đoạn DNA plasmid.
Hình 10: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của mang gen mã hóa protease HIV-1 trong plasmid tái tổ hợp
Đường chạy 1-3: Sản phầm PCR plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng Đường chạy 4: Đối chứng âm (không có khuôn DNA)
Đường chạy 5: Thang chuẩn DNA 1Kb
Đường chạy 6: Sản phẩm PCR khuẩn lạc xanh
Kết quả điện di sản phẩm PCR thu được ở hình 10 cho thấy sản phẩm PCR với khuôn là plasmid tinh sạch từ khuẩn lạc trắng cho băng DNA nhân bản kích thước khoảng 0,64 kb như tính toán lý thuyết (hình 10, đường chạy 1-3). Trong khi đối chứng âm không có DNA (hình 10, đường chạy 4) không cho băng nhân bản nào. Như vậy, chúng tôi có thể khẳng định plasmid tinh sạch được có chứa đoạn gen mã hoá protease HIV-1 mong muốn và được ký hiệu là pGEM-ProtHA.
Để một lần nữa khẳng định gen mã hoá protease HIV-1 đã được nhân dòng vào vector pGEM-T, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong plasmid tái tổ hợp pGEM-ProtHA. Trình tự gen thu được sau đó được so sánh với trình tự
của đoạn gen mã hóa protease trong vector pCR2.1-Prot. Kết quả (không nêu ở đây) khẳng định phần gen mã hóa cho protease có trình tự trùng khớp 100% với đoạn gen này trong vector pCR2.1-Prot.
3.2.3. Đƣa gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc vào vector pET32a
Vector pET32a (sơ đồ cấu tạo ở hình 11) được dùng để biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T. Đây là vector có kích thước 5,9 kb, chứa trình tự đa điểm cắt, mang promoter mạnh của thực khuẩn thể T7 thuận tiện cho biểu hiện nhiều loại protein tái tổ hợp khác nhau. Đồng thời pET32a còn có protein dung hợp Thioredoxin (TRX) ở đầu N làm tăng độ hòa tan của protease HIV-1 và 6 gốc His ở đầu cuối C ngay trước mã kết thúc rất thuận tiện cho quá trình tinh sạch.
Sau khi nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T gắn thêm trình tự HA vào vector pGEM-T, chúng tôi tiến hành xử lý vector pGEM-ProtHA và vector pET32a bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và XhoI nhằm tạo các đầu dính tương thích cho phản ứng gắn sau này. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn sau đó được tinh sạch. Kết quả điện di gel agarose 1% sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA sau tinh sạch (hình 12) cho thấy chúng tôi đã thu được 2 băng DNA rõ nét, một băng có kích thước khoảng 5,9 kb tương ứng với kích thước vector pET32a (hình 12, đường chạy 3) và một băng có kích thước khoảng 0,34 kb tương ứng với kích thước của gen mã hóa protease HIV-1 (hình 12, đường chạy 1).
Hình 12: Điện di sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA bằng BamHI và XhoI
Đường chạy 1: Gen mã hóa protease HIV-1 sau khi được xử lý bằng BamHI và XhoI Đường chạy 2: Thang chuẩn DNA 1 kb
Đường chạy 3: Vector pET32a sau khi được xử lý bằng BamHI và XhoI
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng gắn đoạn gen mã hóa protease HIV- 1 vào vector pET32a bằng enzym T4 DNA ligase. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 4oC qua đêm (12-16 giờ), sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và cấy trải trên đĩa LB có bổ sung 50 g/ml ampicillin và 34 g/ml cholramphenicol, nuôi qua đêm ở 37oC. Kết quả thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Một số khuẩn lạc trắng
được chọn ngẫu nhiên để xác định sự có mặt của gen trong vector bằng phương pháp PCR trực tiếp với hai cặp mồi T7 promoter/teminator (gọi tắt là cặp mồi T7Fw/Rv) có trình tự dựa trên trình tự của vector pET32a. Một phản ứng với với khuôn là pET32a nguyên bản không chứa đoạn gen mã hóa protease HIV-1 cũng được tiến hành để làm đối chứng. Theo tính toán lý thuyết, các khuẩn lạc có chứa vector pET32a-ProtHA tái tổ hợp, khi PCR sử dụng cặp mồi T7 sẽ cho băng DNA kích thước khoảng 1,1 kb bao gồm 0,34 kb của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và đoạn 0,74 kb của vector. Còn phản ứng với khuôn là pET32a nguyên bản, khi PCR sử dụng cặp mồi này sẽ chỉ cho băng DNA kích thước khoảng 0,74 kb.
Hình 13: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 có trong các thể biến nạp
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 1kb Đường chạy 2: Đối chứng âm
Đường chạy 4: Sản phẩm PCR pET32a nguyên bản Đường chạy 3;5: Sản phẩm PCR với khuôn là khuẩn lạc
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (hình 13) cho thấy sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi T7Fw/Rv với plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng cho băng DNA kích thước khoảng 1,1 kb (hình 13, đường chạy 3 và 5) trong khi vector pET32a nguyên bản chỉ cho băng khoảng 0,74 kb (hình 13, đường chạy 3).
Để khẳng định chắc chắn vector pET32a tái tổ hợp thu được mang đoạn gen mã hoá protease HIV-1, chúng tôi đã tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32a.
Hình 14: Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32-ProtHA
: Axit amin mở đầu và trình tự Trx.Tag
: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI và Spe I : Trình tự tự cắt
: Trình tự protease HIV-1 mang đột biến N83T : Trình tự 9 axit amin HA
: Trình tự của enzyme XhoI : Trình tự 6 His.Tag
Kết quả đọc trình tự cho thấy đoạn gen mã hóa proteasae HIV-1 được đưa vào vector pET32a đúng vị trí và khung đọc, vector tái tổ hợp được gọi là pET32- ProtHA (hình 14); trình tự gen mã hóa protease HIV-1 trong pET32-ProtHA giống 100% với trình tự gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pGEM-ProtHA (hình 15). Như vậy, có thể khẳng định chắc chắn chúng tôi đã gắn thành công đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện pET32a.
Hình 15: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32-ProtHA và vector pGEM-ProtHA