biến N83T trong vector pET32a
Việc thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T được dựa trên cơ sở kết quả biểu hiện gen protease HIV-1 của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể (dẫn liệu chưa công bố). Cụ thể là đoạn gen mã hóa cho protease HIV mang đột biến kháng thuốc N83T được đưa vào vector pET32a dưới dạng protein dung hợp như được mô tả ở hình 7. Trong đó thioredoxin và đuôi his- tag là của vector pET32a, còn trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1, đoạn HA mã hóa cho epitope của kháng nguyên vỏ hemagglutinin (HA) của virus cúm tại đầu C của protease HIV -1 là do chúng tôi dự kiến thiết kế để đưa vào cùng với gen mã hóa cho protease HIV-1. HA có ái lực rất mạnh với gel protein G- sepharose hay gel anti-HA-agarose, nhờ đó sẽ giúp tăng khả năng tinh sạch protease tái tổ hợp. Epitope của HA bao gồm 9 axit amin là YPYDVPDYA, kích thước nhỏ nên thường không ảnh hưởng đến đặc tính của protein đích.
Theo cách thiết kế này, nếu gen mã hóa cho protease HIV-1 được biểu hiện và không có hoạt tính tự cắt của protease HIV-1 tại liên kết Phe-Pro thì protein tái tổ hợp được tạo thành sẽ dung hợp thioredoxin tại đầu N, có đuôi HA và His-tag, với tổng số 282 gốc axit amin với khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. Ngược lại, nếu protein tái tổ hợp tự cắt tại vị trí đặc hiệu của protease HIV-1 thì sẽ tạo ra protease HIV-1 tái tổ hợp gắn đuôi HA và His-tag với KLPT khoảng 12 kDa.
Hình 7: Sơ đồ cấu trúc protein dung hợp với protease HIV-1 để biểu hiện trong vector pET32a
3.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc N83T
Để tạo được hệ thống vector biểu hiện gen mã hóa protease mang đột biến kháng thuốc N83T, chúng tôi buộc phải nhân bản lại đoạn gen đã có trong vector pCR2.1-Prot bằng PCR để đưa thêm các trình tự mong muốn vào hai đầu của gen.
Chúng tôi sử dụng cặp mồi HIV-Fw1 và HIV-Rv3 có trình tự như sau: HIV-FW1: 5’-GGGCGGATCCACTAGT
BamHI SpeI
GGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’
Gen gag
HIV-RV3:
5’-AGTCCTCGAGAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAAAATTTA
XhoI HA (Hemagglutinin)
AAGTGCAGCCAATCTG-3’
PCR được thực hiện với các điều kiện phản ứng nêu trong mục 2.2.4, sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 2%. Kết quả thu được (hình 8) cho thấy chúng tôi đã thu được một băng DNA có kích thước khoảng 0,34 kb đúng với tính toán lý thuyết (đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 dài 297 bp của gen mã hóa protease và 21 nucleotide của phần mồi được thiết kế gắn thêm trình tự tự cắt của protease HIV-1, 27 nucleotide của HA cùng với vị trí cắt enzyme giới hạn). Mẫu đối chứng âm (hình 4, đường chạy 2) không cho băng DNA nào. Như vậy, sơ bộ có thể kết luận rằng chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng cặp mồi HIV Fw1/Rv3.
Hình 8: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen của protease HIV
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 100 bp
Đường chạy 2: Đối chứng âm (không có khuôn DNA)
Đường chạy 3: Sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa protease HIV-1