Sản phẩm PCR được tổng hợp với sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase sẽ có đầu adenosine monophosphate (A) do hoạt tính gắn thêm đầu tận cùng không phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn của enzyme Taq DNA polymerase. Trong khi đó, vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega được thiết kế có chứa một gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 3’.
Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T được thể hiện ở bảng 2.
Bảng 2. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T
STT Thành phần Thể tích (l) 1 Sản phẩm PCR 2 2 Đệm T4 DNA ligase 2X 5 3 T4 DNA ligase 1 4 Vector pGEM-T 1 5 ddH2O 1 Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 3 tiếng, sau đó sử dụng cho biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E. coli DH5 được lấy ra từ tủ lạnh sâu -80oC để trên đá 10 phút cho tan dần, sau đó được bổ sung hỗn hợp phản ứng gắn ở trên, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào. Hỗn hợp biến nạp được làm sốc nhiệt ở 42o
C trong 45 giây, làm lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 500 l 94oC-40 giây
53oC-30 giây 72oC-30 giây 40 chu kỳ
môi trường LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp. Các tế bào sau biến nạp được giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và tiếp đến nuôi lắc ở tốc độ 180 vòng/phút ở 37o
C trong 60 phút. 50-100 l hỗn hợp biến nạp được cấy trải trên đĩa LB đặc có chứa ampicillin g /ml, cơ chất X-gal 20 mg/ml và chất cảm ứng IPTG 0,1 mM và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm. Các thể biến nạp được sơ bộ nhân ra bằng màu sắc của khuẩn lạc và được kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR và xác định trình tự gen.
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phƣơng pháp Sanger
Plasmid từ các thể biến nạp được tách và tinh sạch bằng kit của Hãng Fermentas như được mô tả ở mục 2.2.2 và được sử dụng để xác định trình tự đoạn gen đích.
Nguyên tắc: Xác định trình tự dựa trên phương pháp kết thúc kéo dài chuỗi
nhờ dideoxyribonucleotide của Sanger và tập thể [31]. Các ddNTP do không chứa nhóm –OH tại vị trí 2’ của gốc đường nên khi được enzyme DNA polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể tham gia hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide mới và khiến cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại. Như vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đưa ra trình tự đoạn DNA gốc.
Quy trình tiến hành: Khuôn cho phản ứng PCR được chuẩn bị để xác định
trình tự, sản phẩm PCR đoạn gen mã hoá cho protease HIV-1 được pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol).
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6 l hỗn hợp DTCS (Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 l khuôn, 1 l mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngược), H2O vô trùng vừa đủ 20 l.
Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ gồm 3 bước: 96oC trong 30 giây, 56oC trong 30 giây, 60oC trong 4 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR này được xử lý trước khi đưa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bước sau:
- Dung dịch dừng phản ứng gồm: 20 l CH3COOK 3 M pH 5,2, 20 l EDTA 100 mM pH 8, 10 l glycogen và trộn đều. 5 l dung dịch dừng phản ứng được bổ sung vào 1 phản ứng PCR 20 l và trộn đều.
- Bổ sung vào hỗn hợp 60 l ethanol 95% giữ ở -20oC. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Dịch nổi được hút bỏ và thu kết tủa. Kết tủa được rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 l ethanol 70% giữ ở - 20oC và được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được hút bỏ cẩn thận bằng pipet, kết tủa được để khô ở nhiệt độ phòng sau đó được hoà tan trở lại bằng 40 l dung dịch SLS (sample loading solution). Mẫu sau khi xử lý được giải trình tự bằng hệ thống đọc trình tự CEQ-8000 của hãng Beckman Coulter .
2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli
Để gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện pET32a, cả plamid tái tổ hợp pGEM-Prot và vector pET32a đều được cắt bằng hai enzyme
BamHI và XhoI để tạo các đầu dính, thành phần phản ứng cắt được nêu ở bảng 3, thời gian phản ứng là 3h giờ, ở 37oC.
Bảng 3. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn
Thành phần phản ứng Vector pET32a Plasmid pGEM-Prot
Khuôn 40 l 40 l Đệm II 10x 10 l 10 l BSA 10x 10 l 10 l dd H2O 37 l 37 l BamHI (20 đơn vị/l) 3 l 3 l XhoI (20 đơn vị/l) 5 l 5 l
Sản phẩm cắt enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. Sau khi các băng DNA đã phân tách, phần gel chứa DNA quan tâm được cắt riêng, chuyển sang ống eppendorf sạch. Quy trình tinh sạch DNA từ gel agarsore bằng kit thôi gel của Bioneer được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trước tiên, đệm gắn mẫu (gel binding buffer–GB) chứa NaI được bổ sung vào mẫu, hỗn hợp được ủ ở 60oC cho tới khi gel tan hoàn toàn (5-10 phút). Trong trường hợp kích thước đoạn DNA
cần tinh sạch nhỏ hơn 200 bp hay lớn hơn 3 kb, hỗn hợp được bổ sung isopropanol để tăng khả năng thu hồi DNA. Sau khi được trộn đều, hỗn hợp được nạp lên cột kèm theo kit. Cột được ly tâm trong 1 phút để loại bỏ đệm gắn mẫu, sau đó rửa hai lần bằng 500 l đệm rửa (washing buffer-WB) có chứa EtOH, ly tâm trong 1 phút để loại bỏ dịch rửa. Sau đó, cột được tiếp tục ly tâm trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn EtOH. DNA gắn trên cột được thu lại bằng cách bổ sung 30 l dung dịch đệm rửa chiết (elution buffer–EL) vào cột gel và ly tâm trong 1 phút.
Sau khi thu đã thu được hai sản phẩm gen mã hóa protease HIV-1 và vector pET32a đã được tinh sạch, phản ứng gắn được thực hiện ở 22oC trong 3 giờ với thành phần phản ứng gồm: 7 l vector pET32a (đã xử lý bằng enzyme giới hạn), 10 l gen mã hóa protease HIV-1 (đã xử lý bằng enzyme giới hạn), 2 l đệm T4 DNA ligase 10x, 1l T4 DNA ligase. Tổng thể tích phản ứng là 20 l, hỗn hợp phản ứng được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) có RIL và sự có mặt của gen đích trong các thể biến nạp được xác định bằng PCR.
Tế bào E. coli BL21 (DE3) có RIL mang plasmid pET32a-Prot chứa gen mã hoá proteasae HIV-1 được nuôi qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút trong môi trường LB có chứa 50 μg/ml ampicilin và 34 μg/ml chloramphenicol, dịch khởi đầu sau đó được trẻ hoá trong 150 ml LB lỏng theo tỷ lệ 1:30-1:50. Môi trường chứa tế bào tiếp tục được nuôi cấy cho tới khi A600 đạt tới giá trị từ 0,7 đến 0,8; IPTG được bổ sung đạt nồng độ cuối cùng 0,1 mM để cảm ứng quá trình biểu hiện protein. Sau 3 đến 4 giờ cảm ứng, tế bào được thu bằng ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và hoà trở lại trong đệm có bổ sung PMSF 1 mM. Dịch tế bào được làm lạnh trên đá, siêu âm để phá màng tế bào, giải phóng protein, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC để thu dịch chiết.
2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
Nguyên tắc: các protein chứa trình tự Histidine (His-tag) có ái lực cao với ion
Ni2+. Do vậy, những protein này có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên gel His- bind (có giá thể được gắn thêm gốc Ni2+), sau đó protein đích gắn trên cột được thu lại bằng cách rửa chiết protein ra khỏi gel với Imidazol, là chất có cấu tạo tương tự His.
Tiến hành: Gel His-bind ở dạng trương nở sẵn được nhồi vào cột (kích thước 1x2 cm) để có thể tích cột gel 2 ml. Cột gel được xử lý Ni2+ nồng độ 50 mM để tạo phức hệ gắn; sau đó được cân bằng với đệm A (Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa NaCl 100 mM, ure 8 M, và Imidazol 5 mM). Phân đoạn kết tủa tế bào chứa protease HIV-1 được cho lên cột với tốc độ 10 ml/giờ. Các protein không gắn với gel được loại bỏ dần bằng cách rửa cột với đệm A có Imidazol 20 mM đến khi OD280‹ 0,1.
2.2.9. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phƣơng pháp của Laemmli [20]
Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 4% và gel tách là 15% với tỷ lệ thành phần được ghi ở bảng 4.
Bảng 4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide
Thành phần Gel tách 15% Gel cô 4%
Dung dịch acrylamide 30% 1,97 ml 0,16 ml 4x Tris HCl/SDS pH 8,8 0,94 ml 4x Tris HCl/SDS pH 6,8 0,31 ml Nước cất 0,94 ml 0,76 ml APS 10% 30 l 20 l TEMED 7 l 5 l
Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp được trộn đều đúc vào khuôn kính đã được gắn sẵn trên giá đỡ. Gel tách được đúc trước, bề mặt gel được phủ một lớp butanol tuyệt đối để mặt gel phẳng. Sau khi phần gel tách được trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và cài lược để tạo các Đường chạy, để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein được trộn vào đệm mẫu (nồng độ 4X gồm Tris-HCl, glycerol, SDS, β-mercaptoethanol, bromophenol blue) theo tỷ lệ thể tích 3:1, xử lý nhiệt ở 950C trong 5 phút, làm lạnh nhanh trên đá và dùng để tra Đường chạy chạy điện di.
Đệm chạy điện di là Tris-Glycine pH 8,8 có chứa SDS 1%, quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) chạm mép bản gel thì dừng lại.
Gel được nhuộm bằng dung dịch CBB 0,5% pha trong hỗn hợp methanol: axit axetic: H2O với tỷ lệ thể tích là 3: 6: 1 trong khoảng 20 phút, màu thuốc nhuộm được tẩy bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western blotting) blotting)
Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa protease HIV-1 (kháng nguyên)
và kháng thể đơn dòng kháng protease. Phức hợp protease-kháng thể tiếp tục được nhận biết bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phosphatase kiềm, cuối cùng phức hợp proteasse- kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp được phát hiện bằng cách cho ủ trong dung dịch cơ chất. Nhờ sự có mặt của enzyme trên kháng thể thứ cấp mà cơ chất chuyển từ không màu thành sản phẩm có màu, dễ dàng nhận biết bằng mắt thường.
Các bước tiến hành:
Protein sau khi được tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE, được chuyển lên màng PVDF bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có chứa 10% methanol. Trong quá trình điện chuyển, vị trí các băng protein được giữ nguyên. Màng được cố định bằng dung dịch BSA 1% trong đệm Tris-HCl 10 mM, pH
7,4 qua đêm ở 4oC hoặc bằng cách lắc nhẹ 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Màng được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%
để loại bỏ BSA thừa.
Màng sau đó được ủ với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (kháng thể sơ cấp), lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC.
Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%. Sau đó màng được ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng được loại bỏ bằng cách tráng rửa màng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%.
Các băng protein được hiện màu bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p- nitro blue tetrazolium chloride và 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) pha trong đệm Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 có MgCl2 5 mM và NaCl 0,1 M. Phản ứng được làm ngừng trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có chứa EDTA 20 mM, pH 8,0 khi các băng protein hiện rõ.
2.2.11. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phƣơng pháp của Richard và tâ ̣p thể [31]
Nguyên tắc của phương pháp : Protease HIV-1 chỉ nhận ra và phân cắt tại vị
trí đặc hiệu nếu cơ chất có chứa bất kì một trong 7 liên kết của trình tự tương ứng trên polyprotein gag của virus. Bằng cách tổng hợp một cơ chất Lys-Ala-Arg-Val- Leu*Nph-Glu-Ala-Met có chứa vị trí phân cắt đặc hiệu của protease HIV-1 với sự có mặt của nhóm 4-NO2- phenylalanine (Nph) thay cho phenylalanine, cơ chất có khả năng hấp phụ ở bước sóng 300 nm. Dưới tác dụng hoạt tính phân cắt của protease, liên kết bị phân giải cho độ giảm hấp phụ ở bước sóng 300 nm trên máy quang phổ kế [9, 29].
Tiến hành: Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 5. Hỗn hợp phản
ứng được trộn đều, đo ở bước sóng 300 nm trong 10 phút trên hệ thống máy quang phổ khả biến DU800 của hãng Beckman Coulter.
Bảng 5. Thành phần của phản ứng hoạt tính protease HIV-1
Thành phần Thể tích (μl) dd H2O khử ion, khử trùng 136
Đệm 2x 150
Cơ chất tổng hợp đặc hiệu 12 Protease HIV-1 tái tổ hợp 2
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Trong một nghiên cứu trước đây, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [3] đã tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa cho protease của HIV đã sử dụng kỹ thuật PCR lồng với hai cặp mồi HIV Fw1/Rv1 (cặp mồi ngoài) và HIV FW2/RV2 (cặp mồi trong). Trong nghiên cứu này, các tác giả (chúng tôi là đồng tác giả) đã nhân bản thành công đoạn gen kích thước khoảng 0,34 kb mã hóa cho protease HIV từ 8 trong số 50 bệnh nhân được bệnh viện xác nhận là nhiễm HIV-1. Trong số 8 mẫu dương tính này chỉ có 2 bệnh nhân thuộc nhóm đã và đang điều trị thuốc kháng virus (trong đó có thuốc ức chế protease-PI). Đoạn gen cũng đã được nhóm tác giả nhân dòng và lưu giữ trong vector pCR2.1 dưới dạng pCR2.1-Prot. Vì vậy chúng tôi đã chọn vector pCR2.1-Prot mang đoạn gen của 01 bệnh nhân điều trị thuốc kháng virus ký hiệu là 02VN.HN27510 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trước hết, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen thu được sau đó được so sánh với trình tự của đoạn gen tương ứng của HIV thuộc phân nhóm CRF01_AE, mã số EU518273 của Trung Quốc [41].
Kết quả giải trình tự (hình 4) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từ vector tái tổ hợp pCR2.1-Prot có độ tương đồng 96% so với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE mã số EU518273 của Trung Quốc. Các vị trị có sự sai khác về trình tự nucleotide so với trình tự EU518273 trên Ngân hàng gen là: A6G, A37G, A43G, T105A, A120G, G225A, A248C, T282C, T285C, C297T. Trình tự gen này đã được chúng tôi đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế với số hiệu HQ890881.
Hình 4: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 so với trình tự đoạn gen tƣơng ứng EU518273 của Trung Quốc
3.1.2. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến N83T) biến N83T)
Chúng tôi đã sử dụng phần mềm Genetyx để dịch trình tự nucleotide của gen