h. Độ phõn giải và cỏc yếu tố ảnh hưởng (sự tỏch hai chất)
2.2.3.Pha tĩnh trong HPLC
Một trong những yếu tố rất quan trọng của HPLC đú là cột sắc ký cú nhồi chất nhồi bờn trong gọi là pha tĩnh. Việc tỏch chất cú tốt hay khụng phụ thuộc nhiều vào pha tĩnh của cột. Nếu xột về trạng thỏi của pha tĩnh người ta chia sắc ký thành sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký lỏng - rắn.
Trong hệ sắc ký lỏng thỡ pha tĩnh là chất lỏng, nú được giữ trong cột tỏch bằng một chất mang trơ.
Cũn trong hệ sắc ký lỏng - rắn thỡ pha tĩnh là một chất rắn xốp cú hạt chất nhồi đường kớnh 3 đến 10 m. Hầu hết cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu hiện nay đều sử dụng loại pha tĩnh rắn. Pha tĩnh rắn được chia làm một số loại như sau: Pha tĩnh trờn nền silica (là chủ yếu), pha tĩnh trờn nền nhụm oxit và pha tĩnh trờn nền cỏc chất cao phõn tử hữu cơ.
Pha tĩnh trờn nền nhụm oxit cho kết quả tỏch khụng ổn định do nú cú rất nhiều loại thự hỡnh mà trong đú chỉ cú dạng gama mới cú tớnh chất sắc ký tốt. Chớnh vỡ vậy nú chỉ được sử dụng nhiều trong sắc ký hấp phụ cổ điển mà ớt được dựng trong HPLC.
Pha tĩnh trờn nền cao phõn tử sử dụng cho kỹ thuật HPLC chưa nhiều do việc ỳng dụng nú cũn nhiều hạn chế. Nhược điểm của loại pha tĩnh loại này là dễ bị trương nở khi thay đổi thành phần dung mụi rửa giải, khả năng chịu ỏp kộm, độ trơ
với kiềm và axớt khụng cao, cỏc nhúm amin trong phõn tử lại dễ bị phõn huỷ, vỡ thế người ta chỉ sản xuất một vài loại chất nhồi này cho sắc ký trao đổi ion.
Pha tĩnh trờn nền silica là loại được dựng nhiều nhất hiện nay trong HPLC. Cú hai loại silica hấp thu đú là loại pha thường và loại pha ngược.
- Sắc ký pha thường: chất nhồi trong sắc ký phõn bố pha thường là cỏc silica trung tớnh, trờn bề mặt nú cú nhúm hoạt động -OH, cỏc chất phõn cực (đú là cỏc silica trần hoặc cỏc silica được gắn cỏc nhúm ankyl cú ớt carbon mang cỏc nhúm chức phõn cực: -NH2, -CN,...). Do cú nhúm này nờn chất nhồi cột loại này là phõn cực và nước dẫn đến ảnh hưởng nhiều đến độ lặp lại cũng như hiệu quả của quỏ trỡnh tỏch sắc ký.
- Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là cỏc silica đó được alkyl húa, sulfonic húa, nitro húa hay amin húa cỏc nhúm -OH trờn bề mặt silica. Việc alkyl húa silica trung tớnh bằng mạch carbon thẳng như -C2, -C8, -C18 hay cỏc gốc canbon vũng như nhõn phenyl đó tạo ra chất nhồi pha ngược. Gốc alkyl cú thể gắn trực tiếp vào mạch silica hoặc cú thể gắn giỏn tiếp qua nguyờn tử O. Cỏc chất nhồi loại nay dựng để tỏch cỏc chất khụng phõn cực, phõn cực và sắc ký cặp ion. Dung mụi chạy sắc ký là những chất phõn cực như nước, methanol, acetonitril,… Vỡ pha tĩnh là loại kỵ nước nờn bề mặt hoạt động của nú khụng bị ảnh hưởng bởi cỏc phõn tử nước do vậy sư tỏch bằng chất nhồi này cú độ lặp lại tốt. Trong rất nhiều trường hợp thỡ thành phần chớnh của pha động lại là nước nờn rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tỏch cỏc chất cú độ phõn cực rất đa dạng: từ rất phõn cực, ớt phõn cực tới khụng phõn cực [8]. Sắc ký phõn bố pha đảo bao gồm cả sắc ký cặp ion: để tỏch hỗn hợp cỏc cation hoặc anion nguời ta đưa vào một anion hoặc cation, một đối ion vào pha động, chất này này liờn kết với pha tĩnh khụng phõn cực và chuyển nú sang dạng trao đổi ion. Khi chất phõn tớch-đi qua cột, cặp ion được hỡnh thành và lưu giữ trờn pha tĩnh. Quỏ trỡnh rửa giải đưa chất phõn tớch ra khỏi cột theo nguyờn tắc sắc ký phõn bố pha đảo nhưng phức tạp hơn vỡ cõn bằng giữa pha tĩnh và thuốc thử tạo cặp ion diễn ra chậm, sự hỡnh
thành cặp ion phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ thuốc thử tạo cặp ion, nhiệt độ.
Ngày nay, pha tĩnh cú nhiều loại nhưng cỏc nghiờn cứu ứng dụng tập trung vào hai loại là chất nhồi pha thường (silica trung tớnh) và chất nhồi pha ngược (silica đó được alkyl húa). Trong hai loại này chất nhồi pha ngược lại được dựng nhiều hơn cả vỡ nú cú thể tỏch được cả cỏc chất phõn cực, ớt phõn cực và khụng phõn cực. Mặt khỏc pha động của nú là những chất phõn cực tan trong nước (nước cũng cú thể là thành phần pha động), vỡ thế nú rất kinh tế và phự hợp cho nước cú độ ẩm cao và khớ hậu khụng ổn định như Việt Nam.