probiotic tiềm năng trên môi trường đồ uống malt-base
4.2.3Những thí nghiệm thủy phân mucin
Hoạt tính mucinolytic được kiểm tra bằng cách sử dụng ba thí nghiệm: phát triển trong môi trường lỏng, phân tích SDS-PAGE các gốc mucin bị thủy phân, và phân tích thủy phân trong đĩa Petri, theo những báo cáo trước đây với những điều chỉnh nhẹ. Trong tất cả các thí nghiệm thủy phân mucin, mucin dạ dày lợn (HGM) được tinh sạch từng phần từ một nguồn thương mại (loại III, Sigma-Aldrich, Inc., MO, Mỹ) được sử dụng sau khi tinh sạch. Mẫu phân thu được từ người lớn khỏe mạnh và mẫu phân được tiệt trùng (121oC, 20 phút) được sử dụng như kiểm soát dương tính và âm tính, theo tuần tự. SDS, amido black, acid acetic, và những thuốc thử khác được mua từ Wako Pure Chemical Industry Ltd, Osaka, Nhật Bản.
Một cách ngắn gọn, 100µl canh trường MRS được ủ trong 10ml môi trường cơ sở chứa 0.3% HGM có hoặc không có 1% glucose, và được cấy ở 37oC trong 48h trong điều kiện kỵ khí (Anaero Pack). Thành phần môi trường cơ sở là 1g BactoTM peptone (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 1g TrypticaseTM Peptone (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 2g dịch chiết nấm men (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 0.1g L-cysteine-HCl, 4ml dung dịch khoáng-1 (0.78% dung dịch K2HPO4), 4ml dung dịch khoáng-2 (0.47% KH2PO4, 1.18% NaCl, 1.2% (NH4)2SO4, 0.12% CaCl2, 0.25% MgSO4.H2O), 3ml dung dịch Fildes (dung dịch máu bộ máy tiêu hóa) và 189ml nước cất. Dung dịch Fildes thường được sử dụng như là một thành phần cho canh trường vi khuẩn kỵ khí liên quan đến hệ vi sinh vật đường ruột. Sau khi ủ, sự phát triển của vi khuẩn được định mức bằng cách đo sự hấp thụ tại 600nm (Hitachi Spectrophotometer; Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Nhật Bản) và pH của canh trường vi sinh vật. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần.
Canh trường môi trường cơ sở của mỗi chủng được sử dungtrong SDS- PAGE. Cuối quá trình ủ,10 ml canh trường được ly tâm (10000 g, 4oC, 30 phút) để đạt được chất lỏng tế bào tự do nổi trên bề mặt. Chất lỏng được trộn với 15 ml ethanol tinh luyện 99% và ly tâm lại (10000 g, 4oC, 30 phút). Pellet được thu gom và hòa trong 6ml 0.1M NaCl. Kết tủa ethanol và ly tâm lại được lặp lại hai lần để tinh sạch mucin. Cuối cùng pellet được đình chỉ lại với 0.5ml dung dịch đệm Tris- HCl 10mM và được sử dụng như mẫu SDS-PAGE. Để biểu thị bất kỳ sự thay đổi nào trong thành phần của mucin sau khi ủ trong môi trường lỏng, phần điện
chuyển của những mẫu mucin bị kết tủa bởi ethanol được phân tích bằng SDS- PAGE sử dụng 12.5% polyacrylamide như gel phân chia. Những gel bị bẩn với Coomassie blue (Bio-SafeTM Coomassie, Bio-Rad Laboratories, Inc., Mỹ), cho phần protein, và với cả Coomassie blue và PAS stain (GelCode® Glycoprotein Staining Kit, Thermo Scientific, IL, Mỹ) cho phần glycoprotein.
Thí nghiệm thủy phân mucin trong một đĩa Petri được thực hiện theo báo cáo trước đây. Một cách ngắn gọn, môi trường đĩa thạch được chuẩn bị từ môi trường cơ sở bổ sung thêm 1.5% agar (Becton Dickinson, NJ, Mỹ), 0.3% HGM, có hoặc không có 1% glucose được sử dụng trong thí nghiệm. 10µl môi trường MRS được ủ trên bề mặt của miếng thạch trên đĩa Petri. Những đĩa này được ủ ở 37oC kỵ khí trong 72h và sau đó nhuộm với 0.1% amido black trong 3.5M acid acetic torng 30 phút và sau đó rửa với 1.2M acid acetic. Vùng tiêu hóa mucin (vùng không màu) xung quanh ruột được quan sát.