gen chỉ thị khác nhau là lacZ, gfp và luxAB
Hình 3.1 Kết quả thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị E. coli lacZ. Nồng độ asen trong dung dịch từ trái sang phải (đối chứng - 10 – 50 – 100 – 150 - 200 g/l), từ trên xuống dưới là cặp mẫu lặp lại.
Kết quả thí nghiệm với chủng E. coli lacZ được thể hiện ở hình 3.1. Đây là dãy thí nghiệm tiến hành trong bản nhựa có nhiều giếng với nồng độ asen là 0 - 10 – 50 – 100 – 150 - 200 g/l theo trật tự từ trái sang phải, lặp lại hai lần theo thứ tự từ trên xuống dưới. Tại cặp đầu tiên, mẫu nước không chứa asen nên dung dịch gần như có màu trắng, cặp thứ hai chứa 10 g/l asen và màu của dung dịch hơi xanh nhưng chưa rõ. Bắt đầu từ cặp thứ ba, hàm lượng asen là 50 g/l trở lên thì màu xanh nước biển của dung dịch đã trở nên rõ rệt so với mẫu đối chứng và độ xanh càng đậm khi nồng độ asen trong dung dịch càng cao theo trật tự từ trái sang phải. Như vậy, khi không có asen trong tế bào, hệ gen chỉ thị asen của chủng vi khuẩn E.
được cho phản ứng thuỷ phân cơ chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- - galactoside). Ngược lại, khi có mặt asen thì enzym này được tổng hợp và xúc tác cho phản ứng thuỷ phân đường tạo ra sản phẩm có màu xanh nước biển. Dựa vào sự tương đồng về độ đậm nhạt của màu xanh trong mẫu so với thang dung dịch chuẩn, ta có thể nhận dạng bằng mắt thường nồng độ asen trong mẫu là nhỏ hơn hay cao hơn 50 g/l. Ưu điểm nổi bật khi sử dụng chủng vi khuẩn chỉ thị này là: thí nghiệm tiến hành khá đơn giản, có thể không cần dùng các thiết bị đắt tiền, nếu có thì chỉ là máy so màu thông dụng, giai đoạn cảm ứng và xúc tác đều thực hiện tại 37o
C. Tuy nhiên, khả năng ứng dụng gen lacZ trong phân tích định lượng cũng gặp một số trở ngại. Ví dụ, thời gian để màu xanh của phản ứng thuỷ phân X-gal xuất hiện rõ thường kéo dài từ 1 giờ trở lên. Với khoảng thời gian như vậy, màu xanh ở mẫu đối chứng cũng có ít nhiều, có thể gây nhiễu khi nhận xét kết quả. Điều này được giải thích là do hoạt động của các gen vốn có trên nhiễm sắc thể của E. coli liên quan tới
– galactosidase [74, 82]. Khoảng đáp ứng động học của biosensor hẹp. Như đã thấy trong kết quả thí nghiệm, sự khác biệt về màu sắc chỉ thể hiện rõ ở vùng xung quanh giá trị 50 g/l asen, còn khi hàm lượng asen cao hơn 100 g/l thì các mẫu có màu xanh đậm tương tự nhau. Như vậy, với chủng vi khuẩn này, kết quả đánh giá mức độ ô nhiễm asen mang tính bán định lượng, khó nhận rõ sự khác biệt về độ đậm nhạt của màu xanh khi nồng độ asen trong dung dịch xấp xỉ trên và dưới 50
g/l hoặc khi vượt quá 200 g/l. Nếu sử dụng hoá chất để làm ngừng phản ứng thuỷ phân X-gal sau một khoảng thời gian nào đó, phá vỡ tế bào rồi ly tâm loại bỏ tế bào vi khuẩn, sử dụng máy so màu để đo lượng sản phẩm tạo ra, ta cũng có thể có được kết quả ở dạng số mang tính định lượng hơn [30]. Tác giả Hamer đã đề ra một số biện pháp như pha loãng, xử lý hoá chất sau giai đoạn cảm ứng để giảm nhiễu và tăng độ nhạy của phép thử với – galactosidase [37]. Tuy nhiên, khi số bước thao tác thí nghiệm tăng lên, sai số cũng tăng và làm giảm khả năng ứng dụng ngoài thực địa của biosensor này.
A. Tiêu bản đại diện chụp ở chế độ truyền quang B. Tiêu bản chụp ở chế độ huỳnh quang, mẫu đối chứng C. Tiêu bản chụp ở chế độ huỳnh quang, mẫu chứa 10g/l asen
D.Tiêu bản chụp ở chế độ huỳnh quang, mẫu chứa 50g/l asen E.Tiêu bản chụp ở chế độ huỳnh quang, mẫu chứa 100g/l asen
Hình 3.2 Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang kết quả thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị E. coli gfp.
Kết quả thí nghiệm với chủng E. coli gfp được trình bày trong hình 3.2. Đây là các bức ảnh chụp từ kính hiển vi huỳnh quang các tiêu bản chứa vi khuẩn chỉ thị asen E. coli gfp sau khi sống trong môi trường có chứa asen với nồng độ 0, 10, 50
và 100 g/l khoảng 2 giờ. Chủng vi khuẩn E. coli gfp này chứa hệ gen chỉ thị gồm gen khởi động đáp ứng với asen và gen gfp. Khi tế bào tiếp xúc với asen, gen gfp
phát huỳnh quang khi được kích thích bằng tia tử ngoại. Nếu chụp các tiêu bản ở chế độ soi kính thông thường ta sẽ nhìn thấy tất cả đều có ảnh tương tự nhau, đó là các tế bào E. coli hình que (hình 3.2.A).
Nhưng khi chụp ảnh với chế độ huỳnh quang, ảnh B gần như không có phát huỳnh quang do mẫu không chứa asen tuy vẫn có các tế bào E. coli trên đó như
minh hoạ ở ảnh A. Trên các ảnh C-D-E, các tế bào E. coli phát huỳnh quang màu
xanh lục với độ sáng tăng lên rõ rệt theo sự tăng của nồng độ asen. Ưu điểm nổi bật khi sử dụng biosensor này là không cần cho thêm cơ chất, sản phẩm của gen chỉ thị
gfp là protein phát huỳnh quang màu xanh lục được tạo ra trong tế bào. Kết quả về
mặt cảm nhận màu sắc là rất rõ ràng, gây ấn tượng, tín hiệu tạo ra ổn định. Chính vì vậy, gen gfp thường hay được sử dụng trong thí nghiệm với tế bào nguyên vẹn để
quan sát insitu, hạn chế việc phá tế bào để tách các sản phẩm cần nghiên cứu ra
ngoài [72, 80]. Tuy nhiên, thực nghiệm cũng cho thấy rằng với điều kiện không có phần mềm để chuyển cường độ ánh sáng huỳnh quang sang dạng số hoá thì khó có thể đưa ra con số chính xác về nồng độ asen trong mẫu. Dựa vào ảnh thu được, ta chỉ biết có hay không có asen trong môi trường nhưng giá trị cụ thể là bao nhiêu thì khó trả lời chính xác nên kết quả mới mang tính định tính. Nếu dựa vào các tiêu chuẩn về nước uống của Bộ Y tế Việt Nam hoặc Tổ chức Y tế Thế giới thì các công cụ đo phải cho biết được hàm lượng asen trong mẫu ít nhất là trong khoảng nào, nhỏ hơn hay lớn hơn 10 hay 50 g/l [2, 43]. Thực nghiệm cũng cho thấy thời gian cảm ứng của chủng vi khuẩn này với asen là khá lâu để nhận thấy rõ tín hiệu phát huỳnh quang, thường phải từ 2 giờ trở lên. Tính chất này cũng được nêu trong các nghiên cứu khác, ví dụ tác giả Roberto đã báo cáo khoảng thời gian cảm ứng tạo tín hiệu tối đa ở vi khuẩn E. coli pIRC140 là từ 6 đến 12 giờ [68], còn với tác giả
Stocker là 2 đến 5 giờ [82], thậm chí theo tác giả Hansen khi thử nghiệm với chủng
E. coli mer –gfp là 16 giờ và khả năng phát hiện kém hơn các gen lux và lac [39].
Ngoài ra, khi quan sát ảnh B ta thấy ở mẫu này tuy không có asen nhưng vẫn có một số điểm phát huỳnh quang mờ, điều này được giải thích là do một số thành phần vốn có của môi trường cũng có đáp ứng huỳnh quang tuy không nhiều [68]. Như vậy, để có được kết quả tốt hơn, cần chuyển vi khuẩn E. coli gfp này sang môi
trường mới. Môi trường này phải không có đáp ứng huỳnh quang thì kết quả mới thể hiện sự tương quan rõ nét hơn. Với những phòng thí nghiệm hiện đại, được trang bị kính hiển vi đắt tiền và phần mềm tính toán thì đây là loại biosensor hay được sử dụng. Tuy nhiên, khi xem xét khả năng ứng dụng thực tiễn trong điều kiện Việt Nam thì chúng tôi thấy đây chưa phải là lựa chọn tối ưu khi muốn xây dựng một công cụ phân tích asen tại địa phương tuyến tỉnh và huyện.
Khác hẳn với hai chủng vi khuẩn nói trên, chủng E. coli luxAB lại cho kết
quả hoàn toàn ở dạng số nhờ thiết bị đo cường độ ánh sáng đơn giản. Trong thí nghiệm này, khi vi khuẩn E. coli luxAB tiếp xúc với asen thì gen luxAB hoạt động
và tạo ra luciferase. Enzym này xúc tác cho phản ứng ôxy hoá n-decanal thành axit decanoic và phát quang ở bước sóng 490 nm. Cường độ ánh sáng đo được tỉ lệ thuận với nồng độ asen trong dung dịch như trình bày trong hình 3.3. Đường biểu diễn mối tương quan này có hệ số hồi quy rất tốt (r = 0,998), khoảng tuyến tính nằm từ 0 đến gần 80 g/l asen, giới hạn phát hiện khoảng 10 g/l asen. Sai số chuẩn trung bình của 3 mẫu lặp lại <5%. Như vậy, với chủng vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB, việc phân tích định lượng asen hoà tan trong dung dịch là hoàn toàn có thể
thực hiện được. Ưu điểm nổi bật khi sử dụng biosensor chứa gen chỉ thị luxAB là thí nghiệm đơn giản, kết quả mang tính định lượng với độ nhạy tốt, thời gian thí nghiệm nhanh. Giai đoạn cảm ứng với asen để tạo luciferase là khoảng 1-2 giờ, giai đoạn phản ứng do enzym này xúc tác là 3-5 phút. Trong thực tiễn, gen chỉ thị luxAB cũng đã được nhiều tác giả sử dụng khi tạo ra các biosensor cho asen và các hoá chất ô nhiễm môi trường khác. Theo tác giả Cai, chủng E. coli LF20012 với gen luxAB có khả năng phát hiện asen ở nồng độ 10 ppb (10g/l) [15]. Chủng E. coli
MT102-PIR (pUT-mer-lux) có khả năng định lượng thuỷ ngân trong dịch chiết bằng dung môi nước từ đất ô nhiễm [39].
Hình 3.3 Tương quan giữa cường độ ánh sáng phát ra và nồng độ asen trong dung dịch khi thử nghiệm với vi khuẩn chỉ thị E. coli
Khi so sánh hoạt động của các gen chỉ thị khác nhau, tác giả Hakkila cũng đã cho thấy khả năng phát hiện asen tốt nhất trong thời gian ngắn nhất thuộc về các gen luxCDABE và lucFF, còn các gen gfp có đáp ứng tại nồng độ asen cao hơn và
sau thời gian cảm ứng lâu hơn [36]. Ngoài ra, thí nghiệm đo hoạt tính của luciferase có thể tiến hành trong các ống nghiệm hoặc trong các giếng của bản nhựa 96 giếng. Như vậy, năng suất phân tích mẫu tăng lên rất nhiều, việc ứng dụng chủng vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB để đánh giá ô nhiễm asen trong thực tiễn với số lượng mẫu lớn mang tính khả thi cao.
Sau khi so sánh các tính năng biosensor cho phân tích asen của ba chủng vi khuẩn E. coli với các gen chỉ thị lacZ, gfp và luxAB thì chủng E. coli luxAB là đối
tượng được chọn cho nghiên cứu tiếp theo. Chủng E. coli luxAB này đã thể hiện các ưu điểm về tính đơn giản của phép thử, thời gian thí nghiệm ngắn, kết quả chính xác, mang ý nghĩa định lượng, khả năng ứng dụng thực tiễn lớn. Tuy nhiên, để xây dựng một quy trình phân tích asen với mẫu thực thì còn cần phải tiếp tục tối ưu các
0.0E+001.0E+06 1.0E+06 2.0E+06 3.0E+06 4.0E+06 0 10 20 30 40 50 60 70 80 C ƣ ờ n g đ ộ án h sán g (RL U ) Nồng độ asen (g/l) r = 0,998
thông số thực nghiệm cũng như nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần vốn có trong mẫu nước [40].
3.1.2. Tối ƣu hoá và xây dựng qui trình phân tích asen trong nƣớc giếng khoan bằng chủng vi khuẩn E. coli luxAB