đánh giá mức độ thâm nhiễm asen hiện tại và cung cấp số liệu minh hoạ cơ chế nhiễm độc asen ở ngƣời
Theo quan điểm của các nhà độc học khi một chất độc xâm nhập cơ thể sống, tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và phản ứng của cơ thể mà nó sẽ đi qua các quá trình trao đổi chất khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng quá trình trao đổi chất của hầu hết các chất độc xảy ra theo hai giai đoạn như trong hình 1.2
Chất độc
Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá các chất độc trong cơ thể
Trong pha I của quá trình chuyển hoá, có thể xảy ra các phản ứng như ôxy hoá, khử, thuỷ phân, hydrat hoá dẫn đến sự tạo thành các sản phẩm trao đổi chất có khả năng tan trong nước cao hơn, dễ dàng loại bỏ khỏi cơ thể qua dịch mật hoặc nước tiểu. Sự chuyển hoá trong pha I có thể làm giảm độc tính của hoá chất và bảo vệ cơ thể, nhưng cũng xảy ra những trường hợp ngược lại khi mà độc tính của các sản phẩm trung gian lại tăng lên. Ví dụ, quá trình ôxy hoá tạo ra các sản phẩm hoạt hoá dễ tham gia tạo liên kết với các đại phân tử trong tế bào. Như vậy, từ những hợp chất ban đầu có ít độc tính có thể tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn do chuyển hoá sinh học. Thông thường các dạng chuyển hoá của pha I có thời gian tồn tại trong tế bào rất ngắn, gây khó khăn trong việc nghiên cứu sự tồn tại và hoạt tính của chúng. Tuy thời gian bán huỷ ngắn nhưng với hoạt tính sinh học cao thì các dạng trao đổi chất vẫn có thể gây ra những tổn hại cho tế bào và cơ thể [95].
Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm và dịch tễ học ở người trong nhiều thập kỷ qua đã giúp các nhà khoa học đề xuất mô hình giả thiết về quá trình trao đổi chất của asen ở động vật có vú. Giả thiết này được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu về cơ chế gây độc của asen [9, 44, 86, 92], theo đó asen vô cơ khi vào cơ thể sẽ chuyển hoá theo sơ đồ ở hình 1.3
Pha I
Dạng trao đổi chất
Pha II
Dạng liên kết
Hình 1.3 Sơ đồ giả thuyết về chuyển hoá của asen trong cơ thể người [9]
Theo hình 1.3, As vô cơ hoá trị (V) sẽ được khử thành dạng hoá trị (III). Asen hoá trị (III) sẽ tham gia phản ứng methyloxy hoá để gắn một nhóm methyl và ôxy hoá thành là axit monomethylasonic MMAs(V). Trước khi tham gia phản ứng gắn nhóm methyl thứ hai, As trong hợp chất này lại được khử về dạng As(III) và tồn tại ở dạng axit monomethylasonous MMAs(III). Sản phẩm này tiếp tục methyloxy hoá thành axit dimethylasinic DMAs(V). Dạng này lại được khử một phần về axit dimethylasinous DMAs(III) [9]. Như vậy, quá trình trao đổi chất của asen trong cơ thể bao gồm các phản ứng ôxy hoá-khử và methyl hoá nối tiếp nhau. Các phản ứng ôxy hoá-khử chuyển đổi hoá trị của asen từ asenit As(III) và asenat As(V) và các phản ứng methyl oxy hoá đưa các dạng asenit As(III) thành mono, di và trimethylasenat As(V). H3AsO4 axit asenic H3AsO3 axit asenous (CH3)H2AsO3 monomethylasonic MMAs(V) (CH3)H2AsO2 monomethylasenous MMAs(III) (CH3)2HAsO2 dimethylasinic DMAs(V) (CH3)2HAsO dimethylasinous DMAs(III) Quá trình khử Quá trình methyloxyhoá reductase reductase reductase methyltransferase methyltransferase
Nhìn vào sơ đồ của quá trình trao đổi chất trên ta thấy có thể có tới sáu loại sản phẩm trong cơ thể. Độc tính và sự phân bố trong nước tiểu của các dạng asen hữu cơ kể trên là vấn đề đang được các nhà khoa học rất quan tâm. Tuy nhiên, khả năng xác định được các thành phần asen kể trên chỉ thực hiện được trong những năm gần đây sau khi phương pháp phân tích được phát triển và hoàn thiện [23].
Độc tính của các dạng asen là sản phẩm của quá trình trao đổi chất trong cơ thể.
Như đã trình bày ở trên, khi cơ thể thâm nhiễm asen thì thực chất đó chính là sự thâm nhiễm với các sản phẩm trao đổi chất từ asen chứ không phải chỉ là asen vô cơ trong nước. Các dạng asen vô cơ và hữu cơ đều có độc tính nhưng ở những mức độ khác nhau. Trong một tài liệu tổng quan, tác giả Kenyon đã cho thấy hợp chất DMAs(V) là chất gây ung thư. Hợp chất này kích thích sự bẻ gãy các ADN sợi đơn trong tế bào mô phổi chuột nhắt, chuột đồng và người khi nghiên cứu in vitro. Cơ chế gây ung thư ở đây được cho là do sự tạo thành các gốc peroxyl của DMAs và các dạng ôxy hoạt động [47]. Sử dụng các mô hình động vật khi nghiên cứu bản chất gây ung thư của asen, tác giả Wanibuchi cũng cho thấy DMAs là tác nhân độc cho hệ gen như gây đứt gãy ADN, tạo trao đổi chéo ở nhiễm sắc thể [96]. Khi nghiên cứu một số tác động của các dạng asen vô cơ và hữu cơ lên tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc, tác giả Dopp và các cộng sự thấy rằng có sự tăng số lượng các nhân con, biến đổi nhiễm sắc thể, tăng tần số trao đổi nhiễm sắc tử chị em khi xử lý tế bào với DMAs(III) và MMAs(III). Tiềm năng gây độc cho hệ gen tế bào trong nghiên cứu này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: DMAs(III) > MMAs(III) > Asen vô cơ (III và V) > MMAs(V) > DMAs(V) > TMAsO(V). Sự khác biệt về độc tính này được giả thiết liên quan tới tính thấm qua màng tế bào của các chất kể trên [33].
Nghiên cứu về các dạng asen trong nước tiểu ở quần thể dân cư tại các vùng có ô nhiễm asen trong nước cũng đã được tiến hành trong thời gian qua. Việc tách và định lượng các sản phẩm trao đổi chất của asen được thực hiện nhờ phương pháp phân tích sử dụng hệ thiết bị ghép nối IC – ICPMS. Đó là sắc ký trao đổi ion (Ion
chromatography) có nhiệm vụ tách các hợp chất asen ra khỏi nhau. Khối phổ cảm ứng kết hợp plasma (Induced couple plasma mas spectrometry) có nhiệm vụ nhận dạng và định lượng các hợp chất asen kể trên ở hàm lượng thấp cỡ ppb (10-9
~ g/l) [23, 54].
Phân tích mẫu nước tiểu của trẻ em tại Bắc Achentina, nơi có asen trong nước uống ở nồng độ khoảng 200 µg/l, tác giả Concha cho thấy hàm lượng asen trong nước tiểu là 380 µg/l và cao gấp 10-30 lần so với khu vực đối chứng, nơi có hàm lượng asen là 65 µg/l. Thành phần asen vô cơ là 47%, MMAs 3%, DMAs 50% [29]. Ở người, thông thường các tỉ lệ này có giá trị như sau: asen vô cơ 10 - 30%, MMAs 10 – 20% và DMAs 60 – 70% [91, 42]. Tác giả Tokunaga đã phân tích 44 mẫu nước tiểu thu từ 13 hộ gia đình tại Mushidabad, Tây Bengan Ấn Độ. Các mẫu nước uống có asen trong nằm trong khoảng 18,0 - 408,4 µg/l. Kết quả cho thấy tổng hàm lượng asen trong nước tiểu trung bình là 227 µg/g creatinin với khoảng dao động 20,5 – 2890,0 µg/g creatinin. Trong đó As(III) là 28,7; DMAs là 168,6, MMAs là 25,0 và As(V) là 4,6 µg/g creatinin, tỉ lệ MMA+DMA là 86,7% [87]. Trong một nghiên cứu tại Mêhicô, tác giả Valenzuela đã cung cấp bằng chứng cho thấy sự có mặt của tất cả 6 dạng asen trong nước tiểu, kể cả loại có độc tính cao như MMAs(III) và DMAs(III). Dạng MAsIII đã được tìm thấy trong 98% số mẫu (n=104). Đặc biệt hàm lượng MMAs(III) là cao hơn ở những cá thể có biểu hiện tổn thương da so với cá thể cùng dùng nguồn nước, nhưng không bị mắc các bệnh về da [93]. Tất cả các kết quả nghiên cứu trên cho thấy asen từ nước uống vào cơ thể đã được bài tiết qua nước tiểu với các thành phần chủ yếu là asen hữu cơ với các dạng hoá trị khác nhau. Tuy nhiên sự phân bố của các thành phần asen trong nước tiểu lại không giống nhau giữa các quần thể, cá thể khác nhau, với lý do chưa được tìm hiểu kỹ. Mối tương quan giữa thành phần asen hữu cơ trong nước tiểu với hàm lượng asen vô cơ trong nước uống vẫn đang là vấn đề thời sự. Nó có thể liên quan tới sự thâm nhiễm, chế độ dinh dưỡng, lối sống, giới tính và có thể cả yếu tố di truyền v.v… [44, 52, 91].
Ở Việt Nam, ô nhiễm asen trong nước giếng khoan dùng cho sinh hoạt, nhất là tại khu vực nông thôn, đã được phát hiện. Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp theo
về mức độ thâm nhiễm, xây dựng mối tương quan giữa thâm nhiễm và tích luỹ sinh học, sự trao đổi chất là những vấn đề chưa được đề cập. Để góp phần tìm hiểu vấn đề này, nội dung nghiên cứu thành phần các dạng asen hữu cơ trong nước tiểu ở một số quần thể dân cư đã được tiến hành nhằm đánh giá mức thâm nhiễm asen hiện tại, đồng thời đóng góp thêm bằng chứng minh hoạ cho giả thuyết về trao đổi chất và cơ chế gây độc do asen ở người.
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Mẫu nƣớc giếng khoan, mẫu tóc và mẫu nƣớc tiểu
Mẫu nước giếng khoan dùng cho nghiên cứu ứng dụng biosensor asen được lấy ngẫu nhiên một lần với tổng số 410 mẫu, mật độ lấy mẫu khoảng 1 mẫu /6 km2
. Trong đó, 194 mẫu lấy tại các tỉnh Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên, Hà Nam, An Giang, Đồng Tháp (tháng 5 - 7/2004), 216 mẫu lấy tại Thái Bình, Ninh Bình, Vĩnh Phú, Nam Định (tháng 5 - 7/2005)
Mẫu tóc, mẫu nước tiểu, mẫu nước giếng khoan, mẫu nước đã lọc dùng cho nghiên cứu ứng dụng biomarker được lấy ngẫu nhiên, tại các huyện Từ Liêm (R1), Thanh Trì (R2), Hoài Đức/xã Sơn Đồng (R4) – tháng 12/2003, Tri Tôn (M1), Tân Hồng (M2) - tháng 7/2004, Lý Nhân (R3), lần thứ hai tại Hoài Đức/xã Yên Sở (R4) - tháng 12/2004. Tất cả các mẫu đều được lấy một lần tại các hộ gia đình khác nhau. Các vị trí lấy mẫu được minh hoạ trong hình 2.1.
Số lượng chi tiết mỗi loại mẫu dùng cho nghiên cứu sử dụng biomarker được trình bày trong bảng 2.1. Trong quá trình thu mẫu, chúng tôi đã kết hợp với các cán bộ chính quyền và y tế địa phương tổ chức lấy mẫu tập trung tại trạm y tế xã. Người dân tham gia cho mẫu trên cơ sở tự nguyện đạt tỉ lệ 85-90% theo giấy mời phát ra.
Các mẫu nước, mẫu tóc và nước tiểu được thu thập từ các thành viên trong một số hộ gia đình thuộc các địa điểm đã nêu.
Nƣớc giếng khoan được bơm hút khoảng 5-10 phút để bỏ phần nước đầu đi, sau đó mới lấy mẫu. Nƣớc giếng khoan lọc qua bể cát được lấy trực tiếp từ bể chứa nước đã lọc. Các mẫu nước nói trên được chảy qua màng 0,45m để loại hạt cát và đất nhỏ, chứa đầy trong lọ nhựa PVC sạch (đã rửa bằng axit loãng và tráng bằng nước đã loại ion), thể tích 500 ml, axit hoá tới pH < 2 bằng HNO3 [8].
Tóc được cắt sát da đầu (khoảng 2 g) tại các phần tóc mọc sau gáy và đỉnh đầu. Mẫu tóc được đựng vào các túi polyetylen sạch có khoá chặt. Nƣớc tiểu
Hình 2.1 Bản đồ các vị trí lấy mẫu sinh học
ml) được thu vào lọ nhựa PVC mới (đã rửa bằng axit loãng và tráng bằng nước đã loại ion).
Mẫu nước và mẫu tóc được chuyển về phân tích tại phòng thí nghiệm của Trung tâm nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển bền vững, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Mẫu nước tiểu được bảo quản ở - 20oC và phân tích tại phòng thí nghiệm của Trường Đại học Tổng hợp Ehime, Nhật bản.
Bảng 2.1 Địa điểm và số lượng mẫu thu thập cho nghiên cứu ứng dụng biomarker
Địa điểm Đồng bằng
sông Hồng
Đồng bằng sông Mê kông
Tổng số Số lượng mẫu Từ Liêm Thanh Trì Hoài Đức Lý Nhân Tân Hồng Tri Tôn Nước giếng khoan 19 23 57 15 8 11 133 Nước lọc qua bể cát - 23 57 15 - - 95 Mẫu tóc 44 46 255 56 18 20 439
Mẫu nước tiểu 17 82 35 134
Mẫu biosensor sử dụng các chủng vi khuẩn chỉ thị
Trong luận án này chúng tôi đã sử dụng ba chủng vi khuẩn có đáp ứng với asen được tạo bởi các nhà khoa học thuộc nhóm nghiên cứu sinh học phân tử của Tiến sĩ Jan Roelof Van Der Meer, Viện khoa học và Công nghệ Môi trường Liên bang Thuỵ Sĩ [82]. Ba chủng này đều xuất phát từ chủng vi khuẩn lành tính thường dùng trong phòng thí nghiệm là E. coli DH5 nhưng đã được gắn các plasmit chỉ thị khác nhau. Các plasmit chỉ thị này đều có một gen giống nhau là gen arsR cảm biến với asen, còn phần gen chỉ thị thì khác nhau.
Chủng thứ nhất là E. coli (pMV-arsR) chứa gen chỉ thị lacZ mã cho - galactosidase (gọi tắt là vi khuẩn chỉ thị lacZ).
Chủng thứ hai là E. coli (pJAMA-arsR) chứa gen chỉ thị luxAB mã cho
luciferase (gọi tắt là vi khuẩn chỉ thị luxAB).
Chủng thứ ba là E. coli (pPR-arsR) chứa gen chỉ thị gfp mã cho protein