đáp ứng với asen
Xuất phát từ nhu cầu phát triển công cụ đánh giá ô nhiễm asen nhanh tại hiện trường kết hợp với thành tựu của công nghệ chuyển gen, một số biosensor vi khuẩn đáp ứng asen đã được tạo ra. Về nguyên tắc, các chủng vi khuẩn này chứa gen đáp ứng asen nối với gen chỉ thị (một trong các loại gen chỉ thị đã trình bày ở phần trên), hai gen này cùng hoạt động khi có mặt asen. Vi khuẩn E. coli tự nhiên có
plasmit R773 chứa operon kháng asen gồm 5 gen arsA arsB, arsC, arsD, arsR.
Trong đó gen arsR là gen mã cho protein ức chế vùng khởi động của cả operon ars. Tuy nhiên, khi vi khuẩn E. coli tiếp xúc với asen, operon ars sẽ hoạt động nhưng
không tạo ra các tín hiệu đo được. Dựa vào khả năng kháng asen tự nhiên của E. coli, các tác giả đã thiết kế các plasmit chứa cả gen arsR và gen chỉ thị. Hệ gen này
sẽ tạo ra tín hiệu khi tế bào E. coli tiếp xúc với asen. Sau đây là những ví dụ về các chủng vi khuẩn chỉ thị asen đã được tạo ra.
Tác giả Tauriainen đã tạo ra các chủng E. coli MC1061 (pTOO31) và
E. coli AW3110 (pTOO31) do kết hợp gen arsR từ plasmit R773 và
gen luc ở đom đóm, các chủng này có tín hiệu đáp ứng rõ rệt tại nồng độ asen 0,1M (~7,5 g/l) [92].
Tác giả Roberto đã kết hợp operon R46 và pGFPuv để tạo ra chủng E.
coli pIRC140 có khả năng phát hiện asen ở nồng độ lớn hơn 100 ppb
[68].
Tác giả Stocker đã tạo ra ba chủng vi khuẩn đáp ứng với asenit với ba gen chỉ thị khác nhau dựa trên chủng vi khuẩn không gây bệnh thường dùng trong phòng thí nghiệm là E. coli DH5. Phần cảm biến arsR
nằm trên plasmit pBGD23 [74] vốn cắt từ plasmit R773 của E. coli,
E. coli pMV- arsR có chứa gen chỉ thị lacZ, chủng thứ hai là E. coli
pJAMA-arsR chứa gen chỉ thị luxAB, chủng thứ ba là E. coli pPR-
arsR chứa gen chỉ thị gfp. Các chủng vi khuẩn chỉ thị này có đáp ứng rất tốt với asenit, giới hạn phát hiện asenit trong dung dịch chuẩn là 4
g/l, đáp ứng với asenat có yếu hơn. Các chủng này đã thể hiện tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn rất lớn [82].
Tác giả Rabbow đã tạo ra các chủng Salmonella typhimurim TA1535
chứa plasmit pPLS-1 (ký hiệu là SOS-LUX-TEST) và plasmit pGFPuv (ký hiệu là LAC-FLUORO-TEST). Các chủng vi khuẩn này thể hiện khả năng đáp ứng định lượng với các muối kim loại nặng trong đó có asen [62].
Hiện nay hầu hết các sản phẩm vi khuẩn chỉ thị asen mới chỉ được kiểm nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm khi sử dụng dung dịch chứa asen tinh khiết. Lúc này tính sử dụng sinh học của asen đối với vi khuẩn là nguyên vẹn, không chịu tác động của các yếu tố khác nên thường đạt giá trị đáp ứng cực đại, khả năng phát hiện asen trong mẫu khá tốt. Ngược lại trong thực tiễn, độ hoà tan của asen trong mẫu nước giếng khoan chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, đặc biệt là sự có mặt của sắt. Sự khác biệt rất lớn giữa hàm lượng asen với các thành phần hoá học khác cũng là yếu tố cần lưu ý. Thông thường trong nước giếng khoan, asen ở mức phần tỉ (g/l), trong khi các thành phần hoá học có ảnh hưởng khác như sắt, amonium lại ở mức phần triệu (mg/l), tức là lớn hơn 1000 lần [13]. Việc sử dụng vi khuẩn chỉ thị asen ở nồng độ rất thấp như vậy thường gặp nhiều khó khăn [73].
Độ tan của sắt trong dung dịch nước thấp (hằng số K = 1,84 x 10–3 ở pH<1), ở pH trung tính Fe(III) thường tạo thành các gel keo tụ màu vàng [26]. Nước giếng khoan ô nhiễm asen thường có hàm lượng sắt cao từ 5- 30 mg/l. Khi còn ở trong tầng nước ngầm với tính khử, Fe 2+
ở trạng thái hoà tan. Nhưng khi bơm lên khỏi giếng Fe2+
được ôxy hoá bởi ôxy không khí và chuyển thành Fe(OH)3 kết tủa, kéo theo sự hấp thụ asen trên các hạt keo tụ đó. Quá trình này có thể làm giảm nồng độ asen hoà tan trong nước từ 50 – 80%. Như vậy khả năng sử dụng sinh học asen đối
với tế bào vi khuẩn giảm đi rất nhiều mặc dù asen vẫn có mặt trong mẫu, nhưng không thâm nhập vào tế bào vi khuẩn.
Để góp phần đưa tiến bộ khoa học vào ứng dụng thực tiễn, một trong những nhiệm vụ trọng tâm của luận án là nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích asen trong nước giếng khoan tại Việt Nam bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị. Các nội dung nghiên cứu đã được tiến hành trong phần này là:
Chọn lựa hệ gen chỉ thị phù hợp,
Tối ưu thời gian cảm ứng của biosensor với asen,
Tối ưu hàm lượng cơ chất cho enzym chỉ thị,
Chọn lựa phương pháp hạn chế sự kết tủa của sắt trong nước giếng khoan
Đánh giá độ tin cậy của phương pháp sử dụng biosensor để phân tích asen trong thực tiễn.