Chuẩn bị môi trƣờng: Cân 10 g bacto-trypton, 5 g cao nấm men, 10 g NaCl hoà tan trong 950 ml nước, điều chỉnh pH tới 7,0 bằng dung dịch NaOH 5N, định mức tới 1 lít. Đây là môi trường LB (Luria–Bertani) lỏng, nếu cần môi trường LB thạch thì cho aga vào với nồng độ 13 –15 g/l. Khử trùng ướt ở áp suất 1,05 g/cm2
trong 20 phút.
Nhân giống: Từ ống giống ban đầu cấy gạt ra đĩa thạch chứa môi trường LB có bổ sung ampicillin (đối với chủng E. coli (pMV-arsR), E. coli (pJAMA-arsR)
hoặc kanamicin (đối với chủng E. coli (pPR-arsR) tới nồng độ 50mg/l. Nuôi qua
đêm ở 37o
C. Cấy chuyển một khuẩn lạc từ đĩa thạch sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh như trên, nuôi tiếp 16 giờ trong tủ lắc 37oC, 200 vòng/phút. Tiếp tục cấy chuyển 1 ml dịch vi khuẩn từ ống mẫu nói trên sang bình nón chứa 50ml môi trường LB lỏng và lắc trong 3- 4 giờ. Đặt bình nón vào hộp đá 15 phút, bổ sung 10 ml dung dịch glycerol 87% đã khử trùng và để lạnh. Lắc đều hỗn hợp này rồi chia 1,3ml dịch vi khuẩn nói trên vào các ống eppendorf thể tích 1,5 ml đã vô trùng. Đậy chặt nắp và bảo quản trong tủ lạnh sâu -80o
C [82].
2.2.2. Phân tích hàm lƣợng asen hoà tan trong dung dịch trung tính bằng vi khuẩn chỉ thị khuẩn chỉ thị
Các thí nghiệm sử dụng vi khuẩn chỉ thị để đánh giá hàm lượng asen hoà tan trong dung dịch trung tính về mặt nguyên tắc gồm hai giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất xảy ra sự tiếp xúc của tế bào vi khuẩn với asen, hệ gen chỉ thị hoạt động tạo ra các protein chỉ thị, quy trình thí nghiệm ở giai đoạn này nhìn chung là giống nhau ở cả ba chủng vi khuẩn. Giai đoạn thứ hai xảy ra các phản ứng được xúc tác bởi các protein chỉ thị, giai đoạn này khác nhau ở mỗi chủng vi khuẩn [82].
Thí nghiệm ở phần tiếp xúc với asen
Lấy ống eppendorf chứa dịch vi khuẩn giữ đông ở -80oC ra, làm tan đá ở 30oC ngay trước khi thí nghiệm. Trộn 1,3ml dịch vi khuẩn với 10 ml môi trường
lỏng LB đã khử trùng, lấy 500 l dịch vi khuẩn trong môi trường LB cho vào ống nghiệm hoặc khay chứa 500 l dung dịch asen chuẩn (nồng độ asen từ 0 - 200 g/l) hoặc mẫu nước cần phân tích. Đậy nắp, lắc trong 60 – 120 phút ở nhiệt độ 30 - 37oC, đây là khoảng thời gian asen trong mẫu thâm nhập tế bào vi khuẩn, hệ gen kháng asen và gen chỉ thị cùng hoạt động để tạo ra protein chỉ thị.
Thí nghiệm đo tín hiệu cho từng loại protein chỉ thị.
Thí nghiệm đo hoạt tính của - galactosidase ở vi khuẩn chỉ thị E. colilacZ
Bổ sung 20 l dung dịch cơ chất X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- - galactoside) nồng độ 1 mg/l trong nước vào ống thí nghiệm chứa vi khuẩn chỉ thị asen và mẫu ở phần trên, chờ ít nhất khoảng 1 giờ rồi so sánh bằng mắt độ đậm nhạt của màu xanh tạo thành ở mẫu chuẩn và mẫu thực để suy ra khoảng nồng độ asen trong mẫu thực. Trong thí nghiệm này, - galactosidase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân cơ chất X-gal và tạo ra sản phẩm có màu xanh nước biển. Mức độ đậm của màu xanh tạo thành tỉ lệ với hàm lượng asen trong dung dịch mẫu.
Thí nghiệm đo hoạt tính luciferase ở vi khuẩn chỉ thị E. coliluxAB
Bổ sung dung dịch cơ chất n–decanal 18mM trong dung môi ethanol 99%/nước 1:1 vào ống thí nghiệm chứa vi khuẩn chỉ thị asen và mẫu, chờ 3 phút rồi đo cường độ phát quang bằng máy đo quang Junior – LB 9509. Trong thí nghiệm này, luciferase xúc tác cho phản ứng ôxy hoá n-decanal và phát ra ánh sáng ở bước sóng 490 nm. Cường độ ánh sáng đo được (RLU) tỉ lệ với hàm lượng asen trong mẫu.
Thí nghiệm đo cƣờng độ phát huỳnh quang xanh lá cây của protein ở vi khuẩn chỉ thị E. coli gfp
Hút 1µl dung dịch từ ống thí nghiệm chứa vi khuẩn chỉ thị asen và mẫu, đưa lên lam kính hiển vi, đậy lamen lại. Soi tiêu bản ở kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX 171, nếu kính hiển vi có phần mềm số hoá cường độ huỳnh quang thì thu được số liệu dưới dạng số. Trong luận án này, chúng tôi chỉ quan sát bằng mắt
dưới kính hiển vi huỳnh quang và chụp ảnh. Ở đây bản thân sản phẩm protein huỳnh quang xanh lá cây do gen chỉ thị tạo ra là tín hiệu tỉ lệ với lượng asen có mặt trong dung dịch.