Tốc độ lan tơ của tơ nấm được đo 3 lần bằng thước, đơn vị cm. Lấy giá trị trung bình.
Quan sát hình thái bên ngoài, cắt ngang quả thể, quan sát bào tử, Coremia trên vật kính dầu với độ phóng đại 100, mô tả và chụp hình.
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả số liệu thực nghiệm được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Số liệu được xử lí bằng bảng tính Excel.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích hình thái giải phẫu và bào tử
3.1.1. Loài chuẩn Pleurotus cystidiosus O.K.Miller (1969)
Mũ nấm có đường kính 21 mm, phẳng lồi, cuộn vào lúc còn non, có vết lõm nhẹ ở trung tâm mũ, có nhiều vảy nhỏ khô màu nâu và ít vảy ở tâm mũ. Phiến xếp không đều, men xuống cuống, màu trắng nhưng khi già chuyển sang màu da bò. Cuống dài 11 mm, rộng 7 mm, đính lệch tâm, màu trắng, có nhiều lông tơ bao phủ màu trắng, có vân hợp, thon dần đến gốc. Không có bao trong suốt quá trình phát triển.
Bào tử có kích thước 11-17 x 4,2-5,0 µm, nhìn nghiêng có dạng thoi và trực diện có dạng elip dài, thành mỏng, có màu vàng sáng trong dung dịch Melzer.
Cheilocystidia có kích thước 23-30 x 8,5-12,0 µm hình quả lê hay dạng cầu, thành mỏng, trong suốt trong dung dịch KOH và Melzer. Pleurocystidia có kích thước 24-57 x 8,5-17,0 µm, dạng cầu-có mấu, dạng thoi, thành mỏng đến hơi dày, đơn độc, rải rác hay hình thành các thể bó, có màu nâu vàng trong dung dịch KOH, màu vàng trong dung dịch Melzer, có một vài mấu ở gốc. Pileocystidia thường 39-47 x 6-8 µm, nâu nhạt, hình trụ hay hình trùy.
Trama của mũ có kích thước 2,5-12,0 µm thành mỏng thường có mấu nối, trong suốt đến vàng sáng trong dung dịch KOH và Melzer.
Trama của phiến có đường kính 2,5-7,0 µm thành mỏng, dạng góc, trong suốt trong dung dịch KOH và Melzer, bào tầng phân hóa không rõ rệt.
Sau này mẫu sưu tập ở Đức được Hilber (1982) nghiên cứu kỹ hơn và cho rằng mẫu chuẩn của O. K. Miller (1969) chưa chỉnh lắm (vì thể quả đảm thường lớn hơn nhiều).
3.1.2. Loài Pleurotus abalonus Han, Chen & Cheng (1974)
Các cuống bào tử mọc trên môi trường mùn cưa thường thành nhóm hay rải rác. Mũ nấm có kích thước 5-24 cm với nhiều Pileocystidia ở toàn bộ bề mặt nhưng không có sự phân hóa màng ngoài, bề mặt khô, có màu sám đen hay nâu đậm, có
vết lõm ở tâm mũ. Phiến men xuống cuống, màu trắng kem, đôi khi có màu xám đen rõ nét ở mép mũ.
Cuống đặc chắc, đính lệch tâm, thường dài từ 5-8 cm, đường kính 1-3 cm, màu trắng đến xám nhạt.
Bào tử đảm có kích thước từ 10,5-13,5 x 3,8-5,0 µm, nhẵn, nội chất màu trắng kem. Tứ bào đảm có mấu, kích thước 50-65 x 7-8,5 µm.
Cheilocystidia có dạng chùy đến dạng hình trụ, thành dày màu nâu nhạt, kích thước 23-28 x 8,5 µm. Pleurocystidia có dạng hình thoi, hình chùy hay gần như dạng đảm, thành mỏng, trong suốt, kích thước 38-50 x 6-8 µm. Tán trama trong suốt bao gồm các hệ sợi đan xen với nhau. Subhymenium là hệ sợi hẹp có thành mỏng. Pileocystidia có dạng lông cứng, thành dày, có dạng hình trụ đến hình trùy, màu nâu nhạt đến đậm, kích thước 25-40 x 6-11 µm, có mấu ở đáy, thường tạo các đỉnh hyphal. Caulocystidia tương tự như Pileocystidia.
3.1.3. Loài Pleurotus blaoensis Thám sp.nov (1999)
Thể quả hữu tính có kích thước vào loại khổng lồ (22-26) cm, nhiều quả thể thường đi ra từ gốc cuống dạng chùy, hiếm khi đơn độc, thường mọc chen chúc như ngói lợp. Mũ màu xám đen sau ngả xám nâu –xám nhạt- nâu vàng, phần gốc cuống rất mập, phủ lớp lông mịn trắng, phiến men dài xuống đến gần sát gốc. Bụi bào tử màu trắng sám.
Coremia có dạng dùi nhỏ, dài 2- 6mm, mảnh màu trắng trên đỉnh mang một giọt dịch đen hình cầu, đường kính cỡ 2,5-3,5 mm. Trên các búi có những Coremia lớn vượt lên, màu
Hình 3.1. Nấm P. blaoensis thu hái từ tự nhiên
trắng xám-xám nâu, có dạng chùy, dài tới 6,5-39 mm, chắc mập với chân đế thắt lại cỡ 2,7-3,7 mm, phần trên loe rộng ra tới 3,9-7,9 mm, đôi khi phân thành từ 2-4 nhánh.
Bào tử vô tính sẫm màu, màng khá dày 2,3-2,8 µm, tương đối nhẵn, có nội chất dạng lổn nhổn, hình dạng khá đa dạng: thuôn dài như trái chuối-hạt đậu-bầu dục, đôi khi có dạng ba góc, có mấu lồi đáy, có lẽ là dấu vết điểm đính với khóa. Rất hiếm khi có những bào tử bất thường. Kích thước bào tử biến động lớn: 23,7- 31,5(37) x 5,8-7.4(9,3) µm, đôi khi kiểu hình trụ kéo dài (37,2-45,7 x 6,7 µm). Bó cuống đính bào tử trần thường bao gồm các tế bào thon dài, có khóa.
Cho đến nay vẫn chưa công bố chính thức loài mới này (mới có các thông báo sơ bộ) vì lẽ giản đơn là chờ dịp so sánh mẫu với các loài khác đã biết.
Nhận xét:
- Dựa theo mô tả gốc của các tác giả về hình thái các loài thuộc phân chi
Coremiopleurotus có thể thấy rằng chúng có nhiều nét tương đồng đặc trưng như nhiều Pileocystidia, có Cheilocystidia và Pleurocystidia, không có bao, có sự hình thành các Coremia mang bào tử vô tính, các bào tử đảm tương tự nhau.
- Sự khác nhau giữa bốn loài trên thể hiện ở kích thước màu sắc của mũ, của cuống bào tử, bề mặt mũ, hình thái của Cheilocystidia, Pleurocystidia và Pileocystidia , sự có mặt hay không có mặt của Caulocystidia , kiểu phát sinh và kích thước các thể bó Synnemata hay Coremia.
- Quá trình diễn tiến từ màu đen đậm khi quả thể còn non và nhạt màu dần khi lớn và già là hết sức lý thú ở loài P. blaoensis (thể quả già chuyển dần sang xám vàng-xám nâu-vàng lợt-nâu lợt). Tuy nhiên cần lưu ý là thể quả loài này có thể đạt tới kích thước lớn hiếm có (>30cm) và nặng trên 650-750g. Có lẽ đây là loài nấm bào ngư lớn nhất được biết cho tới nay.
3.2. Kết quả nhân giống và nuôi trồng 3.2.1. Trên môi trường thạch 3.2.1. Trên môi trường thạch
3.2.1.1. Tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm của 3 đối tượng nghiên cứu
Hình 3.2. Ống nghiệm cấy chuyền từ t rái qua phải : P. cystidiosus ; P. abalonus ; P.blaoensis
Bảng 3.1. Tốc độ lan tơ của 3 loài bào ngư đen trên môi trường thạch
Chiều dài sợi nấm (cm) Thời gian
(ngày) P. cystidiosus P. abalonus P. blaoensis
8 2,9 2,7 2,5 14 5,1 4,8 4,5 17 6,5 6,3 5,8 19 7,6 7,3 6,7 21 8,8 8,4 7,7 26 11 10,5 9,8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 8 14 17 19 21 26
thời gian (ngày)
tốc độ (cm
)
P. cystidiosus P. abalonus P. blaoensis
Hình 3.3. Sự tăng trưởng sợi nấm của 3 loài bào ngư đen
trên môi trường thạch
Nhận xét:
Sau 3 ngày đầu kể từ khi cấy giống, mẫu cấy chưa bung sợi do chúng vừa bị tổn thương và chưa thích ứng ngay được với môi trường mới. Đến ngày thứ 4-5 các mẫu cấy đồng loạt bung sợi, sợi nấm Pleurotus cystidiosus bung ra mạnh nhất, đạt tới 0,8 cm, và sợi nấm Pleurotus blaoensis bung ra yếu nhất đạt khoảng 0,25 cm, tuy nhiên các sợi nấm chưa bám vào bề mặt của môi trường, sau ngày thứ 5 đến hết ngày thứ 6, sợi nấm tiếp tục phát triển và ăn sâu xuống bề mặt của môi trường, tới ngày thứ 8, sợi nấm của: Pleurotus cystidiosus đã lan được khoảng 2,9 cm, loài
Pleurotus abalonus 2,7 cm và loài Pleurotus blaoensis là 2,5 cm. Về hình thái, sợi nấm rất mảnh và thưa, màu trắng lợt, có hiện tượng có các sợi nấm vươn dài ra phía trước, phân nhánh. Đến hết ngày 14 sợi nấm lan ra thêm được một khoảng đối các loài Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 5,1 cm; 4,8 cm; 4,5 cm. Tốc độ lan tơ của: Pleurotus cystidiosus (152,78 µm/h) gấp 1,1 lần Pleurotusblaoensis (138,89 µm/h) , còn Pleurotus abalonus ( 145,83 µm/h) gấp 1,05 Pleurotus blaoensis.
Tổ chức của sợi nấm chặt chẽ hơn khi sợi nấm đạt độ tuổi 19 ngày, bề mặt khuẩn lạc có màu trắng ngà, ít có sự phân hóa tổ chức sợi nấm như trước, tơ nấm vươn mạnh ra phía trước, Coremia xuất hiện dày đặc (hình 3.2). Lúc này chiều dài sợi nấm của các loài Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 7,6 cm; 7,3cm; 6,7cm. Tuy vậy, khi quan sát kỹ về hình thái hệ sợi tôi thấy rằng hệ sợi của Pleurotus cystidiosus, Pleurotus abalonus rất dày, tơ nấm bung xốp vươn mạnh ra phía trước. Còn tơ nấm của loài Pleurotus blaoensis mỏng hơn, tơ nấm áp sát vào bề mặt môi trường.
Tiếp tục theo dõi thì tôi nhận thấy rằng đến ngày 21, sợi nấm của 3 loài lan nhanh nhất, thể hiện ở tốc độ sinh trưởng của các loài Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 250,00 µm/h; 229,17 µm/h; 208,33 µm/h. Điều này cũng chỉ ra ở bảng 3.1 và hình 3.3 trên, vì vậy chúng tôi đề nghị nên dùng giống nấm của 3 loài trên là Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis tại thời điểm lần lượt là 21 ngày; 23 ngày; 25 ngày trên môi trường thạch để cấy chuyền giữ giống hoặc làm giống cho sản xuất. Đến ngày 26 thì tơ nấm loài Pleurotus cystidiosus và loài Pleurotus abalonus đã lan đầy ống nghiệm, trong khi đó tơ nấm của loài Pleurotus blaoensis chỉ đạt 9,8 cm so với 11cm ở loài Pleurotus cystidiosus.
Cần chú ý rằng nấm phát triển trong pha sợi rất kỵ ánh sáng, và tính chất này thể hiện đặc biệt rõ trên nấm bào ngư đen, khi cho các bình tam giác có sợi nấm phát triển ra ngoài ánh sáng đặc biệt là ánh sáng trực tiếp từ mặt trời thì sợi nấm ngả vàng rất nhanh, đây là một hình thức tự bảo vệ của sợi nấm trước các bức xạ của ánh sáng mặt trời. Từ đó chúng tôi đề nghị rằng khi nhân giống nấm bào ngư đen trên môi trường thạch thì phải tuyệt đối để trong môi trường có ánh sáng khuếch tán nhẹ.
Như vậy sợi nấm loài Pleurotus cystidiosus vẫn lan nhanh nhất, và loài
Pleurotus blaoensis vẫn lan chậm nhất, tuy nhiên giữa chúng không có sự cách biệt quá lớn, tổ chức sợi nấm của loài Pleurotus blaoensis cũng khá chặt chẽ, tốc độ lan tơ đạt yêu cầu. Tơ nấm 3 loài phát triển tốt trên môi trường PGA cải tiến.
Một điều rất đặc biệt khi quan sát sự phát triển tơ nấm của 3 đối tượng nghiên cứu trên môi trường thạch là khi tơ nấm lan ra thì cũng đồng thời xuất hiện các Coremia cách đỉnh của tơ nấm khoảng 1 cm với những đặc điểm rất đặc trưng được mô tả kỹ ở phần dưới đây.
3.2.1.2. Hình thái đại thể Coremia của 3 đối tượng nghiên cứu
Theo phương pháp của các tác giả nghiên cứu thể Anamorph từ việc tách phân lập mô sợi của thể Telemorph: Pollack & Miller (1976), chúng tôi tách phân lập mô sợi của 3 loài nấm bào ngư trên, nuôi cấy hệ sợi của các loài trên môi trường PGA ở nhiệt độ 28±20C, sau khi hệ sợi phát triển và hình thành các Coremia chúng tôi quan sát hình thái đại thể Coremia của từng loài và nhận thấy rằng:
- Ở loài Pleurotus cystidiosus, Coremia có dạng dùi nhỏ, màu trắng, mảnh, không dài quá 5mm, đôi khi phân thành 2-3 nhánh, có mang một khối dịch đen hình cầu trên đỉnh và trên các Coremia lớn vượt lên lại phát sinh các Coremia nhỏ mọc chi chít hình dùi trống.
- Cuống các loài Coremia ở loài Pleurotus abalonus có màu trắng kem, trên đỉnh có mang các giọt dịch màu đen, kích thước của các Coremia khoảng 0,2-0,3 cm.
- Coremia của loài Pleurotus blaoensis có dạng dùi nhỏ, dài 2-6 mm, mảnh, màu trắng trên đỉnh mang giọt đen chứa bào tử vô tính. Trên các búi có các Coremia lớn vượt lên, màu trắng xám-xám nâu, có dạng chùy dài 6,5-39 mm, chắc mập.
- Hình thái Coremia ở 3 loài trên tương đối giống nhau:đều có dạng dùi trống mang giọt dịch đen trên đỉnh chứa các bào tử vô tính và các giọt dịch đen này dễ dàng tràn vào nhau, dính lại và tuột xuống, phát tán các bào tử vô tính vào môi trường; ngoài các Coremia sơ cấp còn hình thành các Coremia thứ cấp trong quá trình nuôi cấy.
- Tuy nhiên cũng có sự khác biệt giữa các loài trên như sự khác biệt về kích thước của các thể bó hay Coremia (chỉ có Pleurotus blaoensis hình thành các thể bó khổng lồ, có thể phân nhánh lớn tới vài cm, còn ở Pleurotus cystidiosus và
sự phát sinh Coremia ( Coremia ở Pleurotus blaoensis sớm nhất chỉ sau 5 ngày, ở
Pleurotus cystidiosus thì các Coremia mọc chậm nhất).
Chú thích hình 3.4:
A: P. cystidiosus; Coremia dày đặc (A1), có phát sinh thứ cấp và bào tử vô tính (A2).
B: P. abalonus Coremia dày đặc
C: P. blaoensis; thể bó khổng lồ với Coremia thứ cấp (C1 & C2), bào tử vô tính (C3)
3.2.2. Tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm trên môi trường hạt
Để biết được tốc độ lan của tơ nấm trên môi trường hạt (cũng là môi trường nhân giống trong sản xuất) chúng tôi tiến hành cấy giống nấm đã phân lập được vào các chai có chứa môi trường hạt lúa và bổ xung dinh dưỡng như trên. Tiến hành theo dõi và thu nhận kết quả.
Bảng 3.2. Tốc độ lan của tơ nấm với 3 đối tượng nghiên cứu trên môi trường hạt, có bổ xung cám gạo
Chiều dài sợi nấm (cm) Thời gian
(ngày) P. cystidiosus P. abalonus P. blaoensis
8 2,5 2 1,7 14 4 3,7 3,1 17 5 4,6 3,9 19 5,7 5,2 4,5 21 6,6 5,9 5,2 26 8,5 7,8 7 29 9,4 8,8 8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 8 14 17 19 21 26 29
thời gian (ngày)
tốc độ (cm)
P. cystidiosus P. ab alonus P. b laoensis
Hình 3.5. Sự lan của tơ của 3 loài bào ngư đen trong môi trường hạt Nhận xét:
Chúng tôi chọn môi trường hạt lúa để thử nghiệm làm môi trường nhân giống cho 3 loài bào ngư vì những lý do chính sau: Thành phần môi trường dễ kiếm, dễ thực hiện và môi trường này đã được sử dụng để nhân giống thành công cho rất nhiều loại nấm, trong có rất nhiều loài bào ngư khác. Kết quả thu được chỉ ra ở bảng 3.2.
Môi trường này cũng tỏ ra rất thích hợp với 3 đối tượng trên như những số liệu mà chúng tôi đã chỉ ra ở bảng 3.2 và hình 3.5. Chúng tôi nhận thấy rằng sau khi cấy giống từ môi trường thạch vào, sau 3 ngày đầu
quan sát thấy mẫu cấy đứng yên hay chưa bung sợi, có lẽ do tơ nấm chưa thích ứng ngay được với môi trường mới. Đến ngày ngày thứ 6 mẫu cấy bung sợi, tơ nấm từ nhiều phía vươn ra bám vào môi trường. Đến ngày thứ 8 tơ nấm ăn sâu vào môi trường, tơ nấm của: Pleurotus cystidiosus dài 2,5 cm, của Pleurotus abalonus dài 2 cm và loài Pleurotus blaoensis là 1,7 cm. Tơ nấm của 3 loài đều có màu trắng lợt, hệ sợi mảnh, Coremia xuất hiện dày đặc. Sau 19 ngày tuổi, hệ sợi của 3 loài dã trở lên dày hơn, kết cấu chặt chẽ và sợi bện chặt có màu trắng ngà đặc trưng.
Một điều mà chúng ta đều nhận thấy là tốc độ lan tơ của 3 đối tượng trên môi trường lúa chậm hơn trên môi trường thạch. Điều này thể hiện khi so sánh bảng 3.1 và bảng 3.2, tại thời cùng thời điểm 14 ngày tuổi chiều dài của tơ nấm trên môi trường hạt đối với Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 4cm; 3,7 cm; 3,1 cm. Còn tại thời điểm 14 ngày tuổi chiều dài của tơ nấm trên môi trường thạch đối với Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 5,1 cm; 4,8 cm; 4,5 cm. Khi tôi so sánh tại nhiều thời điểm khác, các đối tượng khác cũng thu được kết quả tương tự. Điều này có thể được giải thích là do môi trường thạch