2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị
- Ống nghiệm, pipep các loại - Bông gòn không thấm - Chai thủy tinh
- Đĩa Petri - Bình tam giác - Cân điện tử
- Nồi hấp Autoclauve - Lò hấp, tủ sấy
2.2.2. Nguyên vật liệu và hoá chất
- Môi truờng PGA cải tiến (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): nước chiết (*), Glucose, cao nấm men , Agar.
- (*) Nước chiết gồm có: Giá đỗ, khoai tây, cà rốt.
- Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp hai): Thóc, cám gạo, CaCO3. - Môi trường nuôi trồng ra quả thể: Mùn cưa cao su, cám gạo, vôi bột, vi lượng (KH2PO4, MgSO4…)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm và hình thái Coremia của 3 đối tượng nghiên cứu trên môi trường thạch Coremia của 3 đối tượng nghiên cứu trên môi trường thạch
Môi trường thạch là môi trường dùng để nhân giống cấp một trong sản xuất và cũng là môi trường dùng để giữ giống, ở đây là môi trường PGA cải tiến.
Công thức môi trường PGA cải tiến: - Nước chiết (*) 1 lít.
- Glucose 20 g.
- Cao nấm men 1g, Agar 20g.
(*) Nước chiết gồm có: 75g giá đỗ, 300g khoai tây, 100g cà rốt Môi trường PGA cải tiến được thực hiện như sau:
Khoai tây, cà rốt, giá đỗ được gọt vỏ rửa cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nước, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nước chiết và bổ xung nước cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ xung thêm Agar và cao nấm men, đun cho các chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng 500C (áp vào má có thể chịu được) đem rót vào trong các ống nghiệm, đĩa Petri và bình tam giác, dùng để phân lập, cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm. Với ống nghiệm rót 1/3 ống chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác và đĩa Petri thì đổ dày khoảng 1 cm. Không đổ môi trường vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch. Cũng không đổ môi trường khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trường đã bị đông vón lại. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC (2500F) , 1at trong 25 phút hấp xong để nguội.
Để khảo sát tốc độ lan tơ nấm và mô tả hình thái Coremia của 3 đối tượng nghiên cứu trên môi truờng thạch chúng tôi tiến hành làm như sau:
- Cấy các giống đã phân lập được từ ống giống thuần chủng sang các bình tam giác, đĩa Petri hoặc ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn.
- Ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 30oC, quá trình ủ tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500-1000 lux.
- Tiến hành quan sát và ghi nhận kết quả sau mỗi ngày kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường.
- Vẽ biểu đồ, nhận xét kết quả.
Thu bào tử vô tính: Nuôi cấy hệ sợi của mỗi loài trên môi trường agar để thu các Coremia-dịch đen, quan sát dưới kính hiển vi để mô tả hình thái Coremia của 3 đối tượng nghiên cứu.
2.3.2. Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm cuả 3 đối tượng nghiên cứu trên môi trường hạt trên môi trường hạt
Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo cũng là môi trường chúng tôi chọn để nhân giống cấp hai đối với 3 đối tượng trên.
Công thức môi trường hạt: - Thóc hạt: 89% - Cám gạo: 10% - CaCO3 : 1%
- Nước đủ ẩm: 60-65%
Quá trình chuẩn bị môi trường hạt được tiến hành như sau: Lúa ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì ngừng lại, bổ sung thêm 10% cám gạo, 1 % CaCO3. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC (2500F) trong 90 phút hấp xong để nguội.
Để khảo sát tốc độ lan tơ chúng tôi tiến hành như sau:
- Cấy các giống từ trong môi trường thạch vào trong chai có môi trường hạt - Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng.
- Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường đến khi ăn trắng toàn bộ chai, đo ngẫu nhiên với thời gian ≥2 ngày.
- Nhận xét đặc điểm phát triển. - Xử lí số liệu vẽ biểu đồ mô tả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3. Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm 2.3.3.1.Xây dựng quy trình nuôi trồng 2.3.3.1.Xây dựng quy trình nuôi trồng
Sau khi đã nhân giống thành công 3 đối tượng trên với số lượng khá nhiều, chúng tôi tiến hành nuôi trồng thử nghiệm trên môi trường cơ chất mùn cưa cây cao su. Quá trình nuôi trồng được tiến hành ở trại nấm DONA (thuộc công ty TNHH thương mại DONA, 11 đường Vườn Thuốc, ấp Cây Da, xã Tân Phú Trung, huyện Củ Chi, Tp.HCM).
Công thức giá thể tổng hợp:
- Mùn cưa cao su được loại tạp bẩn - Vôi bột 1%,
- Phân DAP 0.3%, - Cám gạo 10%, - KH2PO4 0.1%, - MgSO4 0.1%
- Nước bổ xung cho đến khi cơ chất đạt độ ẩm 65-70%. Qúa trình chuẩn bị giá thể như sau:
- Ủ mùn cưa thành đống phủ kín bằng bao tải khoảng 2 -3 ngày để phân giải một phần các hợp chất khó hấp thụ như (cellulose, hemicellulose, lignin…) thành các chất dễ hấp thụ hơn như glucose, đồng thời cũng để cơ chất mềm ra, nấm dễ sử dụng.
-Bổ sung dinh dưỡng với tỷ lệ như trên, tiến hành đảo trộn đủ ẩm.
- Cho cơ chất vào các bịch PP hoặc PE khoảng 1.2 -1.5 kg cơ chất ( khoảng 300 g cơ chất khô, quá trình đóng bịch có thể thực hiện bằng tay hoặc bằng máy đóng bịch như ở trại nấm DONA đã làm).
- Thanh trùng bịch cơ chất theo phương pháp Tyndall (khử trùng gián đoạn) trong các nồi hơi ở 100oC trong 4 giờ, sau đó để nguội 24 giờ cho bào tử tạp nhiễm (như mốc cam, mốc xanh) phát triển rồi khử trùng lại với chế độ như trên.
-Để nguội cấy giống.
Sau khi cấy giống tiến hành ủ tơ nấm trong phòng có ánh sáng khuếch tán nhẹ ở nhiệt độ phòng 23-260C, tiến hành quan sát và nhận xét về quá trình phát triển của tơ nấm của các đối tượng trên.
Khi tơ nấm đã lan kín bịch môi trường tiến hành cho nấm vào khu vực chăm sóc ra thể quả, dùng vòi xịt thẳng vào bịch để tắm bịch (rửa sạch bịch) sau đó tháo nút bông, duy trì độ ẩm thích hợp 80-85%, thu nhận kết quả và tiến hành xây dựng quy trình nuôi trồng 3 loài nấm bào ngư đentrên.
2.3.3.2. Tính hiệu suất sinh học của 3 loài nấm Bào ngư đen tại vùng Củ Chi –Tp.HCM Củ Chi –Tp.HCM
Hiệu suất sinh học của nấm bào ngư đen trên giá thể là tỷ lệ giữa lượng thể quả tơi thu hoạch/lượng cơ chất khô.
Khi nấm ra và đạt kích thước tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến hành thu hái và cân đo.
2.3.4. Phương pháp thu nhận kết quả
Tốc độ lan tơ của tơ nấm được đo 3 lần bằng thước, đơn vị cm. Lấy giá trị trung bình.
Quan sát hình thái bên ngoài, cắt ngang quả thể, quan sát bào tử, Coremia trên vật kính dầu với độ phóng đại 100, mô tả và chụp hình.
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả số liệu thực nghiệm được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Số liệu được xử lí bằng bảng tính Excel.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích hình thái giải phẫu và bào tử
3.1.1. Loài chuẩn Pleurotus cystidiosus O.K.Miller (1969)
Mũ nấm có đường kính 21 mm, phẳng lồi, cuộn vào lúc còn non, có vết lõm nhẹ ở trung tâm mũ, có nhiều vảy nhỏ khô màu nâu và ít vảy ở tâm mũ. Phiến xếp không đều, men xuống cuống, màu trắng nhưng khi già chuyển sang màu da bò. Cuống dài 11 mm, rộng 7 mm, đính lệch tâm, màu trắng, có nhiều lông tơ bao phủ màu trắng, có vân hợp, thon dần đến gốc. Không có bao trong suốt quá trình phát triển.
Bào tử có kích thước 11-17 x 4,2-5,0 µm, nhìn nghiêng có dạng thoi và trực diện có dạng elip dài, thành mỏng, có màu vàng sáng trong dung dịch Melzer.
Cheilocystidia có kích thước 23-30 x 8,5-12,0 µm hình quả lê hay dạng cầu, thành mỏng, trong suốt trong dung dịch KOH và Melzer. Pleurocystidia có kích thước 24-57 x 8,5-17,0 µm, dạng cầu-có mấu, dạng thoi, thành mỏng đến hơi dày, đơn độc, rải rác hay hình thành các thể bó, có màu nâu vàng trong dung dịch KOH, màu vàng trong dung dịch Melzer, có một vài mấu ở gốc. Pileocystidia thường 39-47 x 6-8 µm, nâu nhạt, hình trụ hay hình trùy.
Trama của mũ có kích thước 2,5-12,0 µm thành mỏng thường có mấu nối, trong suốt đến vàng sáng trong dung dịch KOH và Melzer.
Trama của phiến có đường kính 2,5-7,0 µm thành mỏng, dạng góc, trong suốt trong dung dịch KOH và Melzer, bào tầng phân hóa không rõ rệt.
Sau này mẫu sưu tập ở Đức được Hilber (1982) nghiên cứu kỹ hơn và cho rằng mẫu chuẩn của O. K. Miller (1969) chưa chỉnh lắm (vì thể quả đảm thường lớn hơn nhiều).
3.1.2. Loài Pleurotus abalonus Han, Chen & Cheng (1974) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các cuống bào tử mọc trên môi trường mùn cưa thường thành nhóm hay rải rác. Mũ nấm có kích thước 5-24 cm với nhiều Pileocystidia ở toàn bộ bề mặt nhưng không có sự phân hóa màng ngoài, bề mặt khô, có màu sám đen hay nâu đậm, có
vết lõm ở tâm mũ. Phiến men xuống cuống, màu trắng kem, đôi khi có màu xám đen rõ nét ở mép mũ.
Cuống đặc chắc, đính lệch tâm, thường dài từ 5-8 cm, đường kính 1-3 cm, màu trắng đến xám nhạt.
Bào tử đảm có kích thước từ 10,5-13,5 x 3,8-5,0 µm, nhẵn, nội chất màu trắng kem. Tứ bào đảm có mấu, kích thước 50-65 x 7-8,5 µm.
Cheilocystidia có dạng chùy đến dạng hình trụ, thành dày màu nâu nhạt, kích thước 23-28 x 8,5 µm. Pleurocystidia có dạng hình thoi, hình chùy hay gần như dạng đảm, thành mỏng, trong suốt, kích thước 38-50 x 6-8 µm. Tán trama trong suốt bao gồm các hệ sợi đan xen với nhau. Subhymenium là hệ sợi hẹp có thành mỏng. Pileocystidia có dạng lông cứng, thành dày, có dạng hình trụ đến hình trùy, màu nâu nhạt đến đậm, kích thước 25-40 x 6-11 µm, có mấu ở đáy, thường tạo các đỉnh hyphal. Caulocystidia tương tự như Pileocystidia.
3.1.3. Loài Pleurotus blaoensis Thám sp.nov (1999)
Thể quả hữu tính có kích thước vào loại khổng lồ (22-26) cm, nhiều quả thể thường đi ra từ gốc cuống dạng chùy, hiếm khi đơn độc, thường mọc chen chúc như ngói lợp. Mũ màu xám đen sau ngả xám nâu –xám nhạt- nâu vàng, phần gốc cuống rất mập, phủ lớp lông mịn trắng, phiến men dài xuống đến gần sát gốc. Bụi bào tử màu trắng sám.
Coremia có dạng dùi nhỏ, dài 2- 6mm, mảnh màu trắng trên đỉnh mang một giọt dịch đen hình cầu, đường kính cỡ 2,5-3,5 mm. Trên các búi có những Coremia lớn vượt lên, màu
Hình 3.1. Nấm P. blaoensis thu hái từ tự nhiên
trắng xám-xám nâu, có dạng chùy, dài tới 6,5-39 mm, chắc mập với chân đế thắt lại cỡ 2,7-3,7 mm, phần trên loe rộng ra tới 3,9-7,9 mm, đôi khi phân thành từ 2-4 nhánh.
Bào tử vô tính sẫm màu, màng khá dày 2,3-2,8 µm, tương đối nhẵn, có nội chất dạng lổn nhổn, hình dạng khá đa dạng: thuôn dài như trái chuối-hạt đậu-bầu dục, đôi khi có dạng ba góc, có mấu lồi đáy, có lẽ là dấu vết điểm đính với khóa. Rất hiếm khi có những bào tử bất thường. Kích thước bào tử biến động lớn: 23,7- 31,5(37) x 5,8-7.4(9,3) µm, đôi khi kiểu hình trụ kéo dài (37,2-45,7 x 6,7 µm). Bó cuống đính bào tử trần thường bao gồm các tế bào thon dài, có khóa.
Cho đến nay vẫn chưa công bố chính thức loài mới này (mới có các thông báo sơ bộ) vì lẽ giản đơn là chờ dịp so sánh mẫu với các loài khác đã biết.
Nhận xét:
- Dựa theo mô tả gốc của các tác giả về hình thái các loài thuộc phân chi
Coremiopleurotus có thể thấy rằng chúng có nhiều nét tương đồng đặc trưng như nhiều Pileocystidia, có Cheilocystidia và Pleurocystidia, không có bao, có sự hình thành các Coremia mang bào tử vô tính, các bào tử đảm tương tự nhau.
- Sự khác nhau giữa bốn loài trên thể hiện ở kích thước màu sắc của mũ, của cuống bào tử, bề mặt mũ, hình thái của Cheilocystidia, Pleurocystidia và Pileocystidia , sự có mặt hay không có mặt của Caulocystidia , kiểu phát sinh và kích thước các thể bó Synnemata hay Coremia.
- Quá trình diễn tiến từ màu đen đậm khi quả thể còn non và nhạt màu dần khi lớn và già là hết sức lý thú ở loài P. blaoensis (thể quả già chuyển dần sang xám vàng-xám nâu-vàng lợt-nâu lợt). Tuy nhiên cần lưu ý là thể quả loài này có thể đạt tới kích thước lớn hiếm có (>30cm) và nặng trên 650-750g. Có lẽ đây là loài nấm bào ngư lớn nhất được biết cho tới nay.
3.2. Kết quả nhân giống và nuôi trồng 3.2.1. Trên môi trường thạch 3.2.1. Trên môi trường thạch
3.2.1.1. Tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm của 3 đối tượng nghiên cứu
Hình 3.2. Ống nghiệm cấy chuyền từ t rái qua phải : P. cystidiosus ; P. abalonus ; P.blaoensis
Bảng 3.1. Tốc độ lan tơ của 3 loài bào ngư đen trên môi trường thạch
Chiều dài sợi nấm (cm) Thời gian
(ngày) P. cystidiosus P. abalonus P. blaoensis
8 2,9 2,7 2,5 14 5,1 4,8 4,5 17 6,5 6,3 5,8 19 7,6 7,3 6,7 21 8,8 8,4 7,7 26 11 10,5 9,8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 8 14 17 19 21 26
thời gian (ngày)
tốc độ (cm
)
P. cystidiosus P. abalonus P. blaoensis
Hình 3.3. Sự tăng trưởng sợi nấm của 3 loài bào ngư đen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trên môi trường thạch
Nhận xét:
Sau 3 ngày đầu kể từ khi cấy giống, mẫu cấy chưa bung sợi do chúng vừa bị tổn thương và chưa thích ứng ngay được với môi trường mới. Đến ngày thứ 4-5 các mẫu cấy đồng loạt bung sợi, sợi nấm Pleurotus cystidiosus bung ra mạnh nhất, đạt tới 0,8 cm, và sợi nấm Pleurotus blaoensis bung ra yếu nhất đạt khoảng 0,25 cm, tuy nhiên các sợi nấm chưa bám vào bề mặt của môi trường, sau ngày thứ 5 đến hết ngày thứ 6, sợi nấm tiếp tục phát triển và ăn sâu xuống bề mặt của môi trường, tới ngày thứ 8, sợi nấm của: Pleurotus cystidiosus đã lan được khoảng 2,9 cm, loài
Pleurotus abalonus 2,7 cm và loài Pleurotus blaoensis là 2,5 cm. Về hình thái, sợi nấm rất mảnh và thưa, màu trắng lợt, có hiện tượng có các sợi nấm vươn dài ra phía trước, phân nhánh. Đến hết ngày 14 sợi nấm lan ra thêm được một khoảng đối các loài Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 5,1 cm; 4,8 cm; 4,5 cm. Tốc độ lan tơ của: Pleurotus cystidiosus (152,78 µm/h) gấp 1,1 lần Pleurotusblaoensis (138,89 µm/h) , còn Pleurotus abalonus ( 145,83 µm/h) gấp 1,05 Pleurotus blaoensis.
Tổ chức của sợi nấm chặt chẽ hơn khi sợi nấm đạt độ tuổi 19 ngày, bề mặt khuẩn lạc có màu trắng ngà, ít có sự phân hóa tổ chức sợi nấm như trước, tơ nấm vươn mạnh ra phía trước, Coremia xuất hiện dày đặc (hình 3.2). Lúc này chiều dài sợi nấm của các loài Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 7,6 cm; 7,3cm; 6,7cm. Tuy vậy, khi quan sát kỹ về hình thái hệ sợi tôi thấy rằng hệ sợi của Pleurotus cystidiosus, Pleurotus abalonus rất dày, tơ nấm bung xốp vươn mạnh ra phía trước. Còn tơ nấm của loài Pleurotus blaoensis mỏng hơn, tơ nấm áp sát vào bề mặt môi trường.
Tiếp tục theo dõi thì tôi nhận thấy rằng đến ngày 21, sợi nấm của 3 loài lan nhanh nhất, thể hiện ở tốc độ sinh trưởng của các loài Pleurotus cystidiosus; Pleurotus abalonus; Pleurotus blaoensis lần lượt là 250,00 µm/h; 229,17 µm/h; 208,33 µm/h. Điều này cũng chỉ ra ở bảng 3.1 và hình 3.3 trên, vì vậy chúng tôi đề