2.1.1. Đối tượng.
- Mẫu thịt gà nguyên con đƣợc bán ở ngoài chợ, siêu thị và chợ cóc. - Chủng Salmonella spp đƣợc phân lập trong mẫu.
2.1.2. Địa điểm.
- Địa điểm lấy mẫu: Chợ và siêu thị trên địa bàn Hà Nội
- Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Bộ Y tế.
2.1.3. Thời gian thực hiện.
Từ tháng 12 năm 2012đến tháng 11 năm 2013
2.1.4. Môi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm.
2.1.4.1 Canh thang tăng sinh chọn lọc.
a. Môi trƣờng Selenite cystine (Môi trƣờng cơ bản):Tryptone 5,0g;Lactose 4,0g;Disodium hydrogenphosphate(Na2HPO4) 10,0g;Sodium biselenite 4,0g; Nƣớc cất1000ml.
- Hoà tan ba thành phần cơ bản đầu tiên trong nƣớc bằng cách đun sôi 5 phút. Để nguội rồi bổ sung Sodium biselenite.
- Chỉnh pH 7,0 ± 0,2(nếu cần).
b. Dung dịch L –cystin:L – cystin 0,1g; Dung dịch Natri hydroxyt, c(NaOH) – 1mol/l 15ml; Nƣớc cất vô trùng, vừa đủ thể tích cuối cùng 100ml.
- Không thanh trùng.
c. Môi trƣờng hoàn chỉnh: Môi trƣờng cơ bản 1000ml;Dung dịch L – cystin 10ml.
- Chỉnh pH 7,0 ± 0,2(nếu cần). Phân phối môi trƣờng vào các ống nghiệm vô trùng, 10ml/ống.
d. Môi trƣờng tổng hợp, lƣợng môi trƣờng cân tuỳ theo hƣớng dẫn ghi trên nhãn hộp của nhà sản xuất.
42
- Phân phối môi trƣờng vào các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 10 ml. Đun sôi cách thuỷ 15 phút. Không thanh trùng bằng nồi hấp áp lực.
- Bảo quản môi trƣờng ở 2- 80C. Thời hạn bảo quản: 1ngày.
Kiểm tra chất lượng môi trường:
- Kiểm tra vô trùng: Để trong tủ ấm 370C / 24 giờ.
- Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028. - Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922.
Lƣu ý:
- Môi trường sử dụng trong ngày.
- Thời gian nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường này không nên để quá 24 giờ vì tác động ức chế của selenite giảm sau 6 – 12 giờ nuôi cấy.
2.1.4.2. Môi trƣờng Magie clorua – lục malachit (Rappaport – Vassiliadis).
a. Dung dịch A: Trypton 5,0g;Natri clorua(NaCl) 8,0g; Kali dihydrogenphosphat (KH2PO4) 1,6; Nƣớc cất 1000ml.
- Hoà tan các thành phần trong nƣớc bằng cách đun nóng đến khoảng 700C. b. Dung dịch B: Magie clorua ngậm 6 nƣớc(MgCl2.6H2O) 400,0g; Nƣớc cất 1000ml.
- Hoà tan Magie clorua trong nƣớc.
- Dung dịch có thể bảo quản trong chai thuỷ tinh màu nâu ở nhiệt độ phòng. c. Dung dịch C: Oxalat lục malachit 0,4g; Nƣớc cất 100ml.
- Hoà tan oxalat lục malachit trong nƣớc.
- Dung dịch có thể bảo quản trong chai thuỷ tinh màu nâu ở nhiệt độ phòng. d. Môi trƣờng hoàn chỉnh: Dung dịch A 1000ml;Dung dịch B 100ml;Dung dịch C 10ml.
- Chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng pH = 5,2 (nếu cần).
- Phân phối môi trƣờng vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp, 10ml/ống.
43
- Bảo quản môi trƣờng trong tủ lạnh 2- 80C. e. Môi trƣờng tổng hợp:
- Cân lƣợng môi trƣờng theo hƣớng dẫn ghi trên nhãn hộp của nhà sản xuất.
- Đun ấm để hoà tan các chất. Phân vào các ống nghiệm vô trùng, 10ml/ống. - Hấp thanh trùng ở 1150C trong 15 phút.
Kiểm tra chất lượng môi trường:
- Thử vô trùng: để ở 370C/ 24h.
- Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028. - Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922.
Lƣu ý:canh thang Rappaport vassiliadis không nên sử dụng nếu mẫu thử
nghi là có S.Typhi.
- Bảo quản môi trƣờng trong tủ lạnh 2- 80C.
2.1.4.3. Môi trƣờng Tetrathionat
a. Thành phần: “Lab - Lemco” powder 0,9g; Peptone 4,5g; Yeast extract 1,8g; Sodium chloride 4,5g; Calcium carbonat 25,0g; Sodium thiosunphate 40,7g; Nƣớc cất 1000ml.pH = 8,0 ± 0,2
b. Chuẩn bị:
- Cân các thành phần riêng rẽ hoặc lƣợng môi trƣờng tổng hợp ghi trên nhãn hộp theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất . Đun sôi để hoà tan các chất. Để môi trƣờng nguội khoảng 450C thì bổ sung 20ml dung dịch iodine. trộn đều và phân vào các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 10ml.
- Không thanh trùng bằng nồi hấp áp lực.
- Cách pha dung dịch Iodine: Iodine 6,0g;Potassium iodine 5,0g;Nƣớc cất 20ml.Môi trƣờng cơ bản có thể bảo quản ở 40C trong một tháng nhƣng môi trƣờng đã bổ sung dung dịch iodine phải sử dụng ngay.
Kiểm tra chất lượng môi trường:
- Kiểm tra vô trùng: để ở 370C / 24 h.
44
- Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922.
2.1.4.4 . Môi trƣờng thạch chọn lọc.
a. Thạch đỏ phenol/ lục sáng (Brilliant green agar):
- Môi trƣờng cơ bản: “ Lab - Lemco” powder 5,0g;Pepton 10,0g;Yeast extract 3,0g;Disodium hydrogenphosphate (Na2HPO4) 1,0g; Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) 0,6g;Thạch bột 12- 18g;Nƣớc cất 1000ml. Hoà tan các thành phần riêng rẽ hoặc môi trƣờng tổng hợp bằng cách đun sôi nhẹ.Không thanh trùng bằng nồi hấp áp lực. Để nguội tớikhoảng 500C thì lắc đều và đổ đĩa.
b. Dung dịch đỏ phenol/đƣờng: Lactose 10,0g; Saccarose 10,0g; Đỏ phenol 0,09g; Nƣớc cất định mức đến thể tích cuối cùng 100ml.
- Hoà tan các thành phần trong nƣớc cất bằng cách đun cách thuỷ 700C trong 20 phút. Để nguội tới khoảng 55 ± 10C và dùng ngay.
c. Dung dịch lục sáng (Brilliant green): Lục sáng 0,0047g; Nƣớc cất 100ml. - Dung dịch bảo quản ở chỗ tối ít nhất một ngày để tự thanh trùng.
d. Môi trƣờng hoàn chỉnh: Môi trƣờng cơ bản (55 ± 10C) 900ml;Dung dịch đỏ phenol / đƣờng (55 ± 10
C) 100ml;Dung dịch lục sáng ( 55 ± 10C) 1ml. -Trộn đều và đổ đĩa, 15 ml môi trƣờng/đĩa peptri.
Kiểm tra chất lượng môi trường
- Kiểm tra vô trùng: để ở 370C/24h.
- Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028. - Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922.
Lƣu ý:Cần hong khô bề mặt môi trường trước khi nuôi cấy. Các đĩa thạch
chưa khô không được giữ quá 4h ở nhiệt độ phòng và không quá 24h trong tủ lạnh.
2.1.4.5.Thạch Hektoen enteric ( Hektoen entericagar):
Proteose peptone 12,0g; Yeast extract 3,0g; Lactose 12,0g; Sucrose12,0g; Salicin 2,0g; Bile salts 9,0g; Sodium chloride 5,0g; Ammonium ferric citrate 1,5g; Acid fuchsin 0,1g; Bromothymol blue 0,065g; Agar 14,0g; Nƣớc cất vô trùng 1000ml.
45
- Lắc nhẹ để môi trƣờng ngấm nƣớc. Đun nóng từ từ cho đến sôi và để trong vài phút để hoà tan thạch.
- Không thanh trùng bằng nồi hấp áp lực.
- Chỉ đổ thạch đĩa khi môi trƣờng nguội xuống khoảng 500C.
- Môi trƣờng tổng hợp: cân môi trƣờng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất ghi trên nhãn hộp. Cách chuẩn bị tƣơng tự nhƣ trên.
Kiểm tra chất lượng môi trường:
- Kiểm tra vô trùng: để ở 370C/24h.
- Thử chứng dƣơng: Salmonella typhimurium ATCC 14028. - Thử chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922.
Lƣuý: Môi trường nên sử dụng ngay. Nếu bảo quản ở 2-8 0C, tối đa chỉ nên giữ từ 3-5 ngày.
2.1.4.6. Môi trƣờng dinh dƣỡng.
a. Thạch dinh dƣỡng (Nutrient agar):“Lab - Lemco” powder 1,0g;Yeast extract 2,0g; Peptone 5,0g;Sodium chloride 5,0g;Thạch 15,0g;Nƣớc cất 1000ml.
- pH = 7,4 ± 0,2
- Thanh trùng bằng nồi hấp áp lực ở 1210C trong 15 phút. b. Môi trƣờng tổng hợp:
- Cân theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất ghi trên nhãn hộp. Chuẩn bị tƣơng tự nhƣ trên.
Kiểm tra chất lượng môi trường:
- Kiểm tra vô trùng: để trong tủ ấm 370C/24h.
- Thử chứng dƣơng: Escherichia coli ATCC 25922.
- Thời hạn bảo quản: ở 2 – 80C, môi trƣờng thạch đĩa để đƣợc một tuần, môi trƣờng đóng bình giữ đƣợc một tháng.
c. Thạch dinh dƣỡng bán đặc:“Lab - Lemco” powder 3,0g;Peptone 5,0g;Thạch 4 – 9g; Nƣớc cất 1000ml.
46
- Đun sôi để hoà tan thạch.
- Chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng pH = 7,0 - Thanh trùng ở 1210C trong 20 phút
Kiểm tra chất lượng môi trường:
- Kiểm tra vô trùng: để trong tủ ấm 370C/24h. - Thời hạn bảo quản: hai tuần ở 2 – 80C.
2.1.4.7. Môi trƣờng canh thang tim nóo (BHI):
Thành phần:Pepton 10,0g; Bột não bê khô 12,5g; Bột tim bò khô; 5,0g. Glucose 2,0g; Natriclorua 5,0g; Natri hydrogenphotphat(Na2HPO4)2,5g; Nƣớc cất1 000ml.
Đun sôi để hoà tan các chất. Điều chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng pH = 7,4.Phân phối môi trƣờng vào ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 10ml.Hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút.Môi trƣờng có thể bảo quản vài tháng ở nhiệt độ 2 – 80C
2.1.5. Hóa chất.
- Các loại đƣờng: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroza, Sucroza, Galactoza, Manitol, Arabinoza - Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
2.1.6 . Kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella.
Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Difco Hòa Kỳ sản xuất và cung cấp và Biorap) dùng để định typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella
2.1.7. Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm.
-Tủ sấy 180 – 2000C; Nồi hấp áp lực; Tủ ấm 37 ±10C, 41,5±10C, 280C ± 10C; Đĩa petri đƣờng kính 90 – 100mm; Pipet có vạch loại xả hết, đã vô trùng 1,5,10 ml ; Nồi cách thuỷ có thể duy trì nhiệt độ từ 44-470C;- Máy đếm khuẩn lạc;- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml;- Cân điện tử; Máy đồng nhất; Máy votex; pH met: chính xác đến ± 0.1 đơn vị pH ở 250
C; Thiết bị để thanh trùng khô (tủ sấy), thiết bị thanh trùng ƣớt ( nồi hấp áp lực); Tủ lạnh; Vòng que cấy: bằng platin/ iridi hoặc niken/crom có đƣờng kính khoảng 3mm; Que cấy thủy tinh;- Các ống nghiệm:
47
kích thƣớc khoảng 16mm x 160mm và 20mm x 200mm; Các ống Durham: phù hợp để dùng các ống nghiệm có kích thƣớc 16mm x 160mm.