2.2.1. Phương pháp lấy mẫu.
Mẫu thịt thịt gà đƣợc mua ngẫu nhiên tại một số chợ và siêu thị trên địa bàn Hà Nội.
Mỗi mẫu đƣợc đựng riêng rẽ vào 1 túi nilon sạch, có ghi rõ ký hiệu mẫu. Các mẫu đƣợc bảo quản trong nhiệt độ lạnh (4-8oC) và chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý mẫu trong cùng ngày.
Bảng 2.1. KẾ HOẠCH MUA MẪU
STT QUẬN SỐ LẦN ĐI TỔNG MẪU SỐ MẪU LẤY TRONG 1 LẦN 1 Hai Bà Trƣng 1 24 24 2 Đống Đa 5 23 4+4+4+4+4+3 3 Ba Đình 4 18 4+4+5+5 4 Đông Anh 4 18 4+4+5+5 5 Chƣơng Mỹ 4 17 4+4+4+5 6 Sóc Sơn 3 16 5+5+6 7 Ba Vì 2 16 8+8 8 Thanh Trì 2 15 7+8 9 Từ Liêm 3 15 5+5+5 10 Hoàng Mai 2 14 7+7 11 Thƣờng Tín 3 13 4+4+5 12 Gia Lâm 3 13 4+4+5 13 Hà Đông 2 13 7+6 14 Ứng Hòa 3 12 4+4+4
48
15 Thanh Xuân 2 12 6+6
Tổng số 43 239
Bảng 2.2. DANH SÁCH CHỢ VÀ SIÊU THỊ MUA MẪU
Quận/
huyện Tên chợ Địa chỉ
Lƣợng mẫu
Hai Bà Trƣng
Chợ Nguyễn Cao Nguyễn Cao – Hai Bà Trƣng – Hà Nội 5 Chợ Hôm Trần xuân Soạn – Hai Bà Trƣng – Hà Nội 5 Chợ Lƣơng Yên Lƣơng Yên – Hai Bà Trƣng – Hà Nội 4 Chợ Bách Khoa Lê Thanh Nghị - Hai Bà Trƣng – Hà Nội 4 Chợ Đông Mác Ô Đông Mác – Hai Bà Trƣng – Hà Nội 4 Intimex Lạc Trung 27 Lạc Trung – Hai Bà Trƣng – Hà Nội 2
Đống Đa
Chợ Tôn Thất Tùng Tôn Thất Tùng – Đống Đa – Hà Nội 4 Chợ Đặng Tiến
Đông Đặng Tiến Đông – Đống Đa – Hà Nội
4
Chợ Láng Đƣờng Láng – Đống Đa – Hà Nội 4 Chợ Thành Công Thành Công – Đống Đa – Hà Nội 4 Chợ Phạm Hồng
Thái Phạm Hồng Thái – Đống Đa – Hà Nội
4
Siêu thị Unimart Số 8 Phạm Ngọc Thạch – Đống Đa – Hà Nội
2
Từ Liêm
Chợ Diễn Diễn – Từ Liêm – Hà Nội 4 Chợ Nhổn Nhổn – Từ Liêm – Hà Nội 4 Chợ Đông Ngạc Đông Ngạc – Từ Liêm – Hà Nội 3 Big C garden Mễ Trì – Từ Liêm – Hà Nội 4 Hoàng
Mai
Chợ Đồng Tâm Minh Khai – Hoàng Mai – Hà Nội 4 Chợ 8-3 Phố 8-3, Hoàng Mai – Hà Nội 3 Chợ Định Công Định Công – Hoàng Mai – Hà Nội 3
49
Metro Hoàng Mai Tam Trinh – Hoàng Mai – Hà Nội 4 Gia
Lâm
Chợ Thạch Bàn Thạch Bàn – Gia Lâm – Hà Nội 3 Chợ Gia Lâm Gia Lâm – Hà Nội 4 Long
Biên
Chợ Gia Thụy Gia Thụy – Gia Lâm - Hà Nội 3 Chợ Ngọc Lâm Ngọc Lâm – Gia Lâm – Hà Nội 3
Ba Đình
Chợ Châu Long Châu Long – Ba Đình – Hà Nội 4 Chợ Bƣởi Bƣởi – Ba Đình – Hà Nội 5 Chợ Ngọc Hà Ngọc Hà – Ba Đình – Hà Nội 5
Đông Anh
Chợ Cổ Điển Xã Hải Bối – Đông Anh – Hà Nội 5 Chợ Bầu Xã Kim Chung – Đông Anh – Hà Nội 5
Vân Trì Vân Trì – Đông Anh – Hà Nội 4 Lam Hồng Lam Hồng – Đông Anh – Hà Nội 4
2.2.2. Phương pháp phân lập và khẳng địnhSalmonella spp..
- Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry, and Egg Products của Bộ nông nghiệp Mỹ (MLG 4.04)
- TCVN 4829 : 2005 (6579: 2002): Phát hiện Salmonella trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
2.2.3.Phương pháp xác định kháng nguyên O, H của vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được.
Xác định serotyp của các chủng Salmonella phân lập đƣợc bằng các phản
ứng ngƣng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Difco, Mỹ) đối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ sở kết quả thu đƣợc, tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại (Kauffmann và White, 2001)[64].
2.2.3.1. Xác định nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đa giá nhóm O.
Sử dụng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (Slide aglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. Đây là phản ứng giữa
50
kháng nguyên và kháng thể đƣợc sử dụng rất phổ biến trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán và giám định các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn đƣợc nuôi cấy vào thạch TSI hoặc thạch thƣờng để tủ ấm 37 oC trong 24 giờ.
+ Kháng huyết thanh chuẩn đa giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kính sạch làm 2 phần: 1 phần làm đối chứng và 1 phần làm thí nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiến kính một giọt nƣớc sinh lý.
+ Lấy một ít khuẩn lạc Salmonella cần định týp đã đƣợc cấy trên thạch TSI hoặc thạch thƣờng, hòa với mỗi giọt nƣớc muối sinh lý đã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kính thành huyền dịch kháng nguyên.
+ Nhỏ tiếp vào bên thí nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh đa giá nhóm O, còn bên đối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nƣớc muối sinh lý. Trộn đều, lắc nhẹ phiến kính trong khoảng 30 – 60 giây.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dƣơng tính khi có cụm ngƣng kết kiểu hạt xuất hiện, huyền dịch xung quanh trong. Bên đối chứng âm huyền dịch vẫn đục đều.
2.2.3.2. Xác định kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đơn giá nhóm O.
Chủng cho kết quả dƣơng tính với kháng huyết thanh O đa giá, tiếp tục đƣợc xác định với các kháng huyết thanh đơn giá. Cách làm tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp đã đƣợc trình bày ở phần 2.3.4.1.
2.2.3.3. Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella.
Sau khi đã xác định kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella , tiếp tục tiến hành xác định kháng nguyên H của chúng. (i) Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1).
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn Salmonella cần định týpđƣợc cấy trên môi trƣờng thạch
51
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trƣờng nƣớc BHI (5ml) để tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm vào canh trùng 5 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý có bổ sung formalin (nƣớc sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục đích là để cố định kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: H a, H b, H c, H d, H e,h , H G, H i, H k, H L, Hr, H y, H e,n , H 1.
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ H a đến H 1 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng Micropipet, hút 450 µl canh trùng Salmonella đã xử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dƣơng tính thì có ngƣng kết kiểu đám mây, các cụm ngƣng kết tƣơng đối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm đục đều. (ii) Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2).
Sau khi có kết quả xác định kháng nguyên H pha 1 của các chủng Salmonella , chúng tôi tiến hành xác định tiếp kháng nguyên H pha 2 của chúng.
+ Hút 3,5 ml môi trƣờng nƣớc thịt HI hoặc BHI có chứa 0.25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 đầu.
+ Để ống nghiệm đó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau đó nhỏ 50µl kháng huyết thanh tƣơng ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm.
+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần định týp, cấy thẳng vào phía trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm. Sau đó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn đã phát triển trong môi trƣờng (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà không bị ức chế), cấy vào 1 ống nghiệm có chứa 5 ml BHI, để nghiêng týp trong tủ ấm 37oC trong vòng 6 giờ.
+ Thêm vào đó 5 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý có bổ sung formalin (nƣớc muối sinh lý + 1% formalin), để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
52
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tƣơng ứng với kết quả của các chủng tạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng micropipet hút 450 µl canh trùng Salmonellađã xử lý ở trên và cho
vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt độ 50 oC trong 1 giờ.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dƣơng tính thì có ngƣng kết kiểu đám mây, các cụm ngƣng kết tƣơng đối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm đục đều.
2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh
- Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twentieth informational supplement M100-S20; 30(1), 2010.
53
54