Hỡnh 5: Sơ đồ nghiờn cứu tỏch dũng và thiết kế vector biểu hiện cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam.
2.2.2. Cỏc kỹ thuật dựng trong nghiờn cứu 2.2.2.1. Tỏch RNA tổng số 2.2.2.1. Tỏch RNA tổng số
Sử dụng mẫu phổi người bị ung thư phổi (mẫu tươi) để tỏch RNA tổng số theo quy trỡnh của kit AccuPrepđ Viral RNA Extraction Kit (Bioneer). Quy trỡnh tỏch chiết gồm cỏc bước chớnh như sau:
- Cõn 20 mg mẫu phổi người cho vào ống eppendorf 1.5 ml. Tỏch RNA tổng số
Mẫu phổi tươi
Tổng hợp cDNA
Cắt-nối tạo cDNA- NK1 hoàn chỉnh
Tỏch dũng cDNA- NK1 hoàn chỉnh Chuyển cDNA-NK1 vào vector biểu hiện pCDNA3, pEGFP-N1
Tỏch dũng vector biểu hiện pCDNA3, pEGFP- N1 mang cDNA-NK1
Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Khuếch đại đoạn 5’-NK1
Tỏch dũng đoạn 5’-NK1 Tỏch dũng đoạn 3’-NK1
Giải trỡnh tự cDNA-NK1 hoàn chỉnh trong vector
- Bổ sung 400 àl Binding Buffer (VB), trộn nhẹ 5 giõy rồi ủ mẫu ở nhiệt độ phũng 10 phỳt để ly giải tế bào.
- Bổ sung 100 àl isopropanol, trộn đều trong 5 giõy, ly tõm nhanh trong 10 giõy. Chuyển phần dịch lờn cột, ly tõm loại bỏ dịch.
- Rửa cột với 500 àl W1 Buffer, ly tõm nhanh trong 1 phỳt để loại bỏ dịch. - Rửa lại cột với 500 àl W2 Buffer, ly tõm nhanh trong 1 phỳt loại bỏ dịch, ly
tõm lại 1 phỳt để loại bỏ cồn trong W2 Buffer. - Bổ sung 50 àl Elution Buffer, ly tõm thu RNA.
2.2.2.2. Phản ứng phiờn mó ngƣợc với enzym AMV Transcriptase
RNA tổng số được tỏch chiết từ mẫu phổi người, sau đú được dựng làm khuụn trong phản ứng phiờn mó ngược để tổng hợp cDNA nhờ enzyme phiờn mó
AMV Transcriptase (Promega). Phản ứng này được thực hiện theo quy trỡnh hướng dẫn của Promega với cỏc bước chớnh sau.
- Bước 1: Trộn RNA và mồi, ủ hỗn hợp ở 70oC, 5 phỳt để biến tớnh RNA rồi ủ ngay vào trong đỏ.
Trong bước này, chỳng tụi sử dụng lần lượt 2 mồi là Hexamer và mồi oligoT để tổng hợp riờng rẽ cDNA từ một mẫu RNA đó tỏch chiết.
- Bước 2: Bổ sung đệm và dNTP, ủ ở 25oC trong 10 phỳt.
- Bước 3: Bổ sung enzyme AMV Transcriptase 300u/àl, thực hiện phản ứng tổng hợp theo chu trỡnh nhiệt: 250C 10 phỳt, 370C 90 phỳt, 850C 10 phỳt. Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC.
2.2.2.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
chu trỡnh nhiệt. Thành phần chớnh của phản ứng gồm cú khuụn DNA, mồi, DNA Polymerase và dNTP. Phản ứng này gồm cú ba giai đoạn chớnh:
Giai đoạn biến tớnh: Dựng nhiệt độ cao (94oC) để tỏch hai mạch của chuỗi DNA xoắn kộp.
Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống để cỏc mồi gắn bổ sung với sợi DNA khuụn. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần nucleotide và chiều dài của mồi được sử dụng trong nghiờn cứu.
Giai đoạn kộo dài:Sử dụng một mạch DNA làm khuụn, DNA polymerase tổng hợp mạch polynucleotide mới theo nguyờn tắc bổ sung.
2.2.2.4. Tinh sạch DNA bằng phương phỏp thụi gel
Sản phẩm DNA điện di trờn gel agarose được tinh sạch theo kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche).
+ Trộn đều 100 àl sản phẩm PCR và 500 àl Binding Buffer, sau đú chuyển hỗn hợp lờn cột ly tõm bỏ dịch nổi.
+ Bổ sung 500 àl Wash Buffer, ly tõm bỏ dịch nổi + Thờm 200 àl Wash Buffer, ly tõm bỏ dịch nổi + Ly tõm tiếp loại bỏ hũan tũan Wash Buffer
+ Bổ sung 50 àl Elution Buffer, ly tõm thu sản phẩm PCR tinh sạch. 2.2.2.5. Nối ghộp cỏc đoạn DNA vào vector
Việc nối cỏc đoạn DNA vào vector được thực hiện quy trỡnh của Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas) để tạo vector tỏi tổ hợp. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme nối T4 ligase ở 160C qua đờm.
2.2.2.6. Kỹ thuật biến nạp
Cỏc vector tỏi tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương phỏp sốc nhiệt. Quỏ trỡnh biến nạp được thực hiện với cỏc vector: vector tỏi tổ hợp pJET
1.2 mang đoạn 5’-NK1 (kớ hiệu p5’-NK1) và pJET 1.2 mang đoạn 3’-NK1 (p3’- NK1), vector pCDNA3-NK1 và vector pEGFP- N1-NK1 mang cDNA-NK1 hoàn chỉnh.
Quỏ trỡnh biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo qui trỡnh trong Molecular Cloning – A Laboratory Manual gồm cỏc bước như sau:
+ Tế bào khả biến E. coli DH5α được để tan trờn đỏ. Bổ sung 10 àl hỗn hợp của phản ứng nối, bỳng nhẹ, ủ trờn đỏ 30 phỳt.
+ Sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giõy, ủ ngay trờn đỏ 3 phỳt.
+ Bổ sung 900 àl mụi trường LB, ủ 37oC trong 15 phỳt. Sau đú, dịch vi khuẩn được lắc 200 vũng/phỳt ở 37oC trong 1 giờ.
+ Trải 100 àl dịch vi khuẩn trờn đĩa thạch LB cú bổ sung Ampicillin 50 àg/ml. Đĩa được ủ ở 37oC qua đờm.
2.2.2.7. Sàng lọc khuẩn lạc
Mụ̃i khuõ̉n la ̣c mo ̣c trờn đĩa tha ̣ch LB bụ̉ sung khỏng sinh được sàng lo ̣c nhanh bằng kỹ thuõ ̣t PCR. Khuõ̉n la ̣c cho băng có kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cỏch nuụi bóo hũa qua đờm trong mụi trường LB bổ sung khỏng sinh (Ampicillin hoặc Kanamycin ) (50 àg/ml), lắc 200 vũng/phỳt ở 370C qua đờm , tỏch plasmid và cắt kiểm tra với enzyme giới hạn .
2.2.2.8. Tỏch plasmid
Plasmid được tỏch theo qui trỡnh trong Molecular Cloning – A Laboratory Manual [201]:
+ Ly tõm thu cặn tế bào.
+ Hoà cặn trong 100 àl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8), trộn đều, ủ ở nhiệt độ phũng 5 phỳt.
+ Thờm 200 àl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), đảo nhẹ, ủ trờn đỏ 3 phỳt.
+ Thờm 150 àl dung dịch III (CH3COOK 3 M pH 5,2), đảo nhẹ, ủ trờn đỏ 5 phỳt, ly tõm thu dịch trong.
+ Bổ sung 450 àl Phenol: Chloroform: Isoamyl (tỉ lệ thể tớch 25:24:1), đảo đều, ly tõm thu pha trờn.
+ Thờm 0,6 thể tớch isopropanol, đảo đều, ủ ở nhiệt độ phũng 10 phỳt, ly tõm thu tủa. Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%, ly tõm thu tủa.
+ Hoà tan tủa trong 30 àl TE bổ sung RNase 20 àg/ml, ủ 37oC trong 30 phỳt. Plasmid được bảo quản ở 4oC. Mẫu plasmid được sử dụng để giải trỡnh tự. 2.2.2.9. Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn
Đờ̉ thiờ́t kờ́ vector tách dòng, vector biờ̉u hiờ ̣n cũng như kiờ̉m tra sự có mă ̣t của gen chuyờ̉n, DNA đươ ̣c cắt với enzyme giới ha ̣n . Thành phần của một phản ứng cắt trong tụ̉ng thờ̉ tích 15 àl được trình bày trong Bảng 8.
Bảng 8: Thành phần của một phản ứng cắt với enzyme giới hạn
Thành phần Thờ̉ tích (àl)
Đờ ̣m của enzyme (10x) 1,5 àl
DNA 50 - 100 ng
Enzyme giới ha ̣n 2 - 5 Unit
H2O Vừa đủ đờ́n 15 àl
Hụ̃n hơ ̣p trờn được trụ ̣n đờ̀u, ủ ở nhiệt độ và thời gian thớch hợp với từng loại enzyme.
2.2.2.10. Kỹ thuật điện di
Điện di là phương phỏp phõn tỏch cỏc đoạn DNA cú kớch thước và cấu hỡnh khỏc nhau. Trong phõn tử DNA chứa nhúm phosphate tớch điện õm nờn trong điện trường của dũng điện một chiều, DNA sẽ di chuyển về phớa cực dương. Tốc độ di chuyển của DNA tỉ lệ nghịch với kớch thước của chỳng.
Sản phẩm của phản ứng PCR, phản ứng tinh sạch, phản ứng cắt được điện di trờn gel agarose 1%, 2% và gel polyacrylamide 8% trong đệm TBE 1X.
2.2.2.11. Phõn tớch trỡnh tự cDNA của cDNA-NK1
So sỏnh trỡnh tự cDNA-NK1 tỏch dũng từ phổi người trong vector pJET 1.2 với trỡnh tự cDNA-NK1 tỏch dũng từ nóo người của một nghiờn cứu khỏc ở Việt Nam bằng BLAST [202]. So sỏnh trỡnh tự cDNA-NK1 trong hệ thống vector biểu hiện sau khi được nhõn dũng.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DềNG GEN MÃ HểA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI PHỔI NGƢỜI
3.1.1. Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người
RNA tổng số từ mẫu phổi tươi được tỏch chiết bằng kit AccuPrepđ Viral RNA Extraction Kit (Bioneer). Sau đú, cDNA được tổng hợp nhờ phản ứng phiờn mó ngược sử dụng RNA tổng số và mồi hexamer. Thành phần và điều kiện của phản ứng tổng hợp cDNA được trỡnh bày trong Bảng 9.
Bảng 9: Thành phần và điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA của gen neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện RNA tổng số 13.0 Ủ 700 trong 5’ để biến tớnh Mồi hexamer (100 àM) 1.5 dNTPs (10 mM) 2.5 Đệm 5x 5.0 - Gắn mồi: 250 trong 10 phỳt - Kộo dài: 370 trong 90 phỳt
- Bất hoạt enzyme: 850 trong 5 phỳt
AMV RTase 3.0
Tổng 25.0
Sản phẩm cDNA được bảo quản ở 4oC để sử dụng cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Đoạn cDNA mó húa cho thụ thể NK1 sẽ được tỏch dũng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đú sẽ được nối với nhau để tạo nờn cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ Hỡnh 6.
Hỡnh 6: Sơđồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mó húa cho neurokinin-1
Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiờn mó ngược để làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 10.
Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.4 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 45 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 àM) 0.5 NK1 R1 (2 àM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA cú kớch thước xấp xỉ 800 bp (Hỡnh 7). Đõy là kớch thước đỳng với tớnh toỏn cho đoạn 5’-NK1. NK1 F NK1 R NK1 R1 NK1 F1 9 4 bp 7 6 bp 9 4 bp Đoạn 5’–NK1 (788 bp) C CCGGG 7 6 bp C CCGGG Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
Hỡnh 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng õm khụng cú cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tỏch dũng đoạn 5’-NK1 của cDNA.
3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1 Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng cDNA làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Tuy nhiờn, sản phẩm PCR gồm cỏc băng DNA khụng đặc hiệu và khụng cú băng DNA với kớch thước 728 bp như mong đợi (Hỡnh 8).
Hỡnh 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi cỏc điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… chỳng tụi vẫn khụng thu được băng mong muốn. Vỡ vậy, chỳng tụi quyết định thực hiện phản ứng phiờn mó ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều kiện của phản ứng phiờn mó ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer bằng mồi oligoT. Sau đú, cDNA này được sử dụng làm khuụn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’- NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 11.
Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.4
- Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 45 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 àM) 0.5 NK1 R (2 àM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 9). Kết quả cho thấy bờn cạnh băng DNA khụng đặc hiệu thỡ đó xuất hiện băng DNA cú kớch thước lớn hơn 700 bp phự hợp với kớch thước đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chỳng tụi tinh sạch đoạn 3’-NK1.
Hỡnh 9: Điện di sản phẩm PCR dựng khuụn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY-100.
3.1.4. Tỏch dũng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Sau khi đó tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng nối được trỡnh bày trong Bảng 12.
Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện Đoạn 5’-NK1 (hoặc đoạn 3’NK1) 8.0 Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đờm Đệm 2x 10.0 pJET 1.2 (50 ng/àl) 1.0 T4 ligase (5 u/ àl) 1.0 Tổng 20.0
Sau đú, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dũng tế bào khả biến E.coli
DH5α. Với mỗi đĩa mụi trường thạch chứa khỏng sinh để sàng lọc cỏc khuẩn lạc nhận plasmid tỏi tổ hợp, chỳng tụi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chốn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Để kiểm tra đoạn chốn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trỡnh bày trong Bảng 13.
Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chốn 5’- NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F (2 àM) 0.5
NK1 R1 (2 àM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/àl) 0.5
Khuụn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn lạc đều cho một băng DNA cú kớch thước phự hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chỳng tụi đó tỏch dũng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Chỳng tụi kớ hiệu bảy khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’- NK1-7.
Hỡnh 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc cỏc khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1. Giếng 1-8 lần lượt là cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng; ĐC: đối chứng õm khụng cú khuụn; M: thang chuẩn SY-500.
Tương tự như sàng lọc cỏc khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chỳng tụi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự cú mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 14.
Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chốn 3’- NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F1 (2 àM) 0.5
NK1 R (2 àM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/àl) 0.5
DNA khuụn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 11). Kết quả cho thấy 5