Đoạn cDNA mó húa cho thụ thể NK1 sẽ được tỏch dũng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 và đoạn 3’-NK1. Hai đoạn này sau đú sẽ được nối với nhau để tạo nờn cDNA hoàn chỉnh như sơ đồ Hỡnh 6.
Hỡnh 6: Sơđồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 của gen mó húa cho neurokinin-1
Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng cDNA được tổng hợp từ phản ứng phiờn mó ngược để làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 10.
Bảng 10: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.4 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 45 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 àM) 0.5 NK1 R1 (2 àM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose. Kết quả điện di cho một băng DNA cú kớch thước xấp xỉ 800 bp (Hỡnh 7). Đõy là kớch thước đỳng với tớnh toỏn cho đoạn 5’-NK1. NK1 F NK1 R NK1 R1 NK1 F1 9 4 bp 7 6 bp 9 4 bp Đoạn 5’–NK1 (788 bp) C CCGGG 7 6 bp C CCGGG Đoạn 3’- NK1 (728 bp)
Hỡnh 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng ĐC: đối chứng õm khụng cú cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tỏch dũng đoạn 5’-NK1 của cDNA.
3.1.3. Khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1 Tương tự như đối với đoạn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng cDNA làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Tuy nhiờn, sản phẩm PCR gồm cỏc băng DNA khụng đặc hiệu và khụng cú băng DNA với kớch thước 728 bp như mong đợi (Hỡnh 8).
Hỡnh 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500.
Lặp lại phản ứng nhiều lần và thay đổi cỏc điều kiện về nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… chỳng tụi vẫn khụng thu được băng mong muốn. Vỡ vậy, chỳng tụi quyết định thực hiện phản ứng phiờn mó ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số. Thành phần và điều kiện của phản ứng phiờn mó ngược được thực hiện như trong Bảng 11, chỉ thay đổi mồi hexamer bằng mồi oligoT. Sau đú, cDNA này được sử dụng làm khuụn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’- NK1 bằng cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 11.
Bảng 11: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.4
- Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 45 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 àM) 0.5 NK1 R (2 àM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 9). Kết quả cho thấy bờn cạnh băng DNA khụng đặc hiệu thỡ đó xuất hiện băng DNA cú kớch thước lớn hơn 700 bp phự hợp với kớch thước đoạn 3’–NK1. Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chỳng tụi tinh sạch đoạn 3’-NK1.
Hỡnh 9: Điện di sản phẩm PCR dựng khuụn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1. Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY-100.
3.1.4. Tỏch dũng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Sau khi đó tinh sạch, từng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 được đưa vào vector pJET1.2 bằng phản ứng nối sử dụng kit Gene JETTM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phần của phản ứng nối được trỡnh bày trong Bảng 12.
Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện Đoạn 5’-NK1 (hoặc đoạn 3’NK1) 8.0 Hỗn hợp nối ủ ở 160Cqua đờm Đệm 2x 10.0 pJET 1.2 (50 ng/àl) 1.0 T4 ligase (5 u/ àl) 1.0 Tổng 20.0
Sau đú, từng hỗn hợp nối được biến nạp vào dũng tế bào khả biến E.coli
DH5α. Với mỗi đĩa mụi trường thạch chứa khỏng sinh để sàng lọc cỏc khuẩn lạc nhận plasmid tỏi tổ hợp, chỳng tụi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chốn bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Để kiểm tra đoạn chốn 5’-NK1, chỳng tụi sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuụn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR được trỡnh bày trong Bảng 13.
Bảng 13: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chốn 5’- NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F (2 àM) 0.5
NK1 R1 (2 àM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/àl) 0.5
Khuụn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 10). Kết quả cho thấy 7 trong 8 khuẩn lạc đều cho một băng DNA cú kớch thước phự hợp với đoạn 5’-NK1. Như vậy, chỳng tụi đó tỏch dũng được đoạn 5’ –NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Chỳng tụi kớ hiệu bảy khuẩn lạc này lần lượt từ 5’-NK1-1 đến 5’- NK1-7.
Hỡnh 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc cỏc khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1. Giếng 1-8 lần lượt là cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng; ĐC: đối chứng õm khụng cú khuụn; M: thang chuẩn SY-500.
Tương tự như sàng lọc cỏc khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chỳng tụi chọn 8 khuẩn lạc để kiểm tra sự cú mặt của đoạn 3’-NK1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 14.
Bảng 14: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chốn 3’- NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F1 (2 àM) 0.5
NK1 R (2 àM) 0.5
Taq DNA polymerase (1 u/àl) 0.5
DNA khuụn 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 11). Kết quả cho thấy 5 trong 8 khuẩn lạc (số 2, 4, 6, 7, 8) đều cho một băng DNA cú kớch thước phự hợp với đoạn 3’-NK1. Như vậy, chỳng tụi đó tỏch dũng thành cụng đoạn 3’–NK1 của cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Chỳng tụi kớ hiệu năm khuẩn lạc này là 3’- NK1-1 đến 3’-NK1-5.
Hỡnh 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc cỏc khuẩn lạc mang đoạn chốn 3’-NK1 bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R. Giếng 1-8 lần lượt là cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng; ĐC: đối chứng õm khụng cú khuụn; M: thang chuẩn SY-500.