Để biểu hiện cDNA mó húa cho thụ thể neurokinin-1 ở người, chỳng tụi sử dụng hai vector biểu hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1. Bước đầu tiờn cần chuyển đoạn cDNA đó tỏch dũng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện. Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn, chỳng tụi khụng thấy enzyme nào trong vị trớ đa điểm của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa món điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tỏi tổ hợp pJET1.2-NK1. Vỡ vậy, chỳng tụi đó thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu hiện. Trỡnh tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trỡnh tự cDNA hoàn chỉnh tỏch dũng từ phổi người Việt Nam. Trong đú ở đầu 5’ của mồi NK1 F3
được thiết kế mang trỡnh tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII và mồi NK1 F3 mang trỡnh tự nhận biết cho enzyme BamHI như Hỡnh 16.
+ NK1 F3: 5’- - 3’
+ NK1 R3: 5’- - 3’
Hỡnh 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK1-3.
Mặt khỏc, chỳng tụi sử dụng mó mở đầu trong trỡnh tự cDNA của NK1 thay vỡ mó mở đầu được thiết kế sẵn trờn vector biểu hiện nờn trong quỏ trỡnh thiết kế mồi chỳng tụi phải chốn thờm trỡnh tự Kozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả năng được phiờn mó và dịch mó của gen trong tế bào nhận.
Với hai mồi được thiết kế mới, chỳng tụi khuếch đại cDNA từ pNK1-3. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được thể hiện trong Bảng 19.
Bảng 19: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 bằng cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.4
- Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 4 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
G T T AC A C GA GAGG A T C C CT AGG AAT
---5’-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC----/-/-/--pNK1--/-/-/---CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-3’--
---
ATTT AAGCTT AC CA T GG ATAA C GT C C TC C
ACCATGG Trỡnh tự Kozak
Hind III
AAGCTT
ATTT AAGCTT ACCATGG ATAACGTCCTCC
GGATCC Bam HI
CTAGGAGAGCACATTG TAA GGATCC
NK1 F3 (2 àM) 0.5 +Gắn mồi : 50 0C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy - Lặp lại 35 chu kỳ +Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
NK1 R3 (2 àM) 0.5
Pfu polymerase 0.1
pNK1-3 1.0
Tổng 15.0
Trong phản ứng PCR, do trỡnh tự mồi thiết kế cú một đoạn nucleotide tương đối dài khụng bắt cặp được vào khuụn nờn trong 4 chu kỳ đầu tiờn, chỳng tụi hạ thấp nhiệt độ gắn mồi để cú thể nhõn đoạn gen mong muốn. Ở cỏc chu kỳ tiếp theo, chỳng tụi tăng nhiệt độ gắn mồi để đảm bảo tớnh đặc hiệu của phản ứng. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chỳng tụi đó thu được băng cú kớch thước xấp xỉ 1237 bp như trỡnh bày trờn Hỡnh 17.
Hỡnh 17: Điợ̀n di sản phõ̉m PCR với khuụn là vector tái tụ̉ hợp pNK1-3 và hai mụ̀i NK1 F3/NK1 R3. Giếng 1: sản phẩm PCR khuếch đại cDNA NK 1; M: thang chuẩn SY - 500; ĐC: đụ́i chứ ng õm khụng cú khuụn DNA.
Như vậy cặp mồi mới thiết kế đó cho phộp nhõn đặc hiệu đoạn cDNA hoàn chỉnh mó húa cho thụ thể neurokinin-1. Đồng thời đoạn DNA mới được nhõn bản
cú mang vị trớ nhận biết của cặp enzyme HindIII/ BamHI ở hai đầu 5’ và 3’. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche) và được kớ hiệu là eNK1 (expression NK1).