Quỏ trỡnh tỏch dũng cDNA hoàn chỉnh mó húa cho thụ thể neurokinin-1 được trỡnh bày trong Hỡnh 12.
Hỡnh 12. Sơ đồ tỏch dũng đoạn cDNA hoàn chỉnh mó cho thụ thể neurokinin-1.
Đầu tiờn chỳng tụi chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tỏch chiết cỏc plasmid tỏi tổ hợp mang đoạn chốn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1. Plasmid này được kớ hiệu p5’-NK1-2 và p3’-NK1-6. Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuụn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1.2. Thành phần và điều kiện của phản ứng được trỡnh bày trong Bảng 15.
Bảng 15: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 trong vector tỏi tổ hợp p5’-NK1-2 bằng cặp mồi NK1 R1/ pJET R
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.4 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn: 94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 120 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 R1 (2 àM) 0.5
pJET R (2 àM) 0.5
Pfu polymerase (1 u/àl) 0.1
p5’-NK1-2 1.0
Tổng 15.0
Sản phẩm PCR được điện di trờn gel agarose (Hỡnh 13). Kết quả cho thấy chỳng tụi đó khuếch đại thành cụng đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi NK1 R1/pJET R.
Hỡnh 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 bằng cặp mồi pJET R/ NK1 R. Giếng 1: sản phẩm PCR bằng cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng õm khụng cú DNA khuụn; M: thang chuẩn SY-100.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) và được cắt bởi hai enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghộp nối với đoạn 3’- NK1. Tiếp theo, chỳng tụi cũng tiến hành cắt vector tỏi tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI. Thành phần phản ứng cắt được trỡnh bày trong Bảng 16.
Bảng 16: Thành phần cắt và điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện H2O 42.0 Ủ 370C trong 2 giờ Đệm Tango 10x 6.0 p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm PCR đoạn 5’-NK1) 8.0 SmaI 2.0 XbaI 2.0
Cỏc sản phẩm cắt với hai enzyme được điện di kiểm tra trờn gel polyacrylamide 8% (Hỡnh 14A). Kết quả cho thấy phản ứng cắt được thực hiện hoàn toàn; cỏc băng DNA được cắt cú kớch thước theo đỳng tớnh toỏn. Băng DNA cú kớch thước 700 bp của đoạn 5’-NK1 và băng DNA cú kớch thước 3341 bp gồm plasmid pJET và đoạn 3’-NK1 được tinh sạch bằng kit của QIAquick Gel
Extraction (QIAGEN) rồi điện di kiểm tra trờn gel polyacrylamide 8% (Hỡnh 14B). Kết quả cho thấy hai băng DNA đó tinh sạch đảm bảo cho phản ứng nối tiếp theo.
Hỡnh 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau khi tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). A: sản phẩm cắt trước khi tinh sạch; B: sản phẩm cắt sau khi tinh sạch; 1: sản phẩm PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau khi cắt; 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt; M: thang chuẩn-100; M1: thang chuẩn 1 kb.
Đoạn 5’-NK1 và vector cú chứa đoạn 3’-NK1 được nối với nhau theo thành phần trỡnh bày trong Bảng 17.
Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện Đệm 2x 10.0 Ủ 160C qua đờm 5’-NK1 5.0 p3’-NK1-6 4.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0
Sau đú, hỗn hợp nối được biến nạp trực tiếp vào dũng vi khuẩn E.coli DH5α theo phương phỏp trỡnh bày trong mục 2.2.2.6. Kết quả trờn mụi trường chọn lọc bổ sung khỏng sinh cú nhiều khuẩn lạc. Chỳng tụi chọn 13 khuẩn lạc để kiểm tra sự cú mặt của đoạn cDNA hoàn chỉnh bằng phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/ NK1 R. Đõy là hai mồi bắt cặp với trỡnh tự ở đầu 5’ và đầu 3’ của cDNA hoàn chỉnh mó cho
9
thụ thể neurokinin-1. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được trỡnh bày trong Bảng 18. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 18: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA hoàn chỉnh mó húa cho thụ thể neurokinin-1
Thành phần Thể tớch (àl) Điều kiện
H2O 10.0 - Thời gian biến tớnh đầu tiờn:
94oC, 5 phỳt
- Lặp lại 40 chu kỡ:
+Biến tớnh: 940C, 30 giõy +Gắn mồi : 600C, 30 giõy +Tổng hợp: 720C, 150 giõy
- Thời gian tổng hợp sau cựng:
720C, 10 phỳt
Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5
dNTPs (2 mM) 1.0
NK1 F (2 àM) 0.5
NK1 R (2 àM) 0.5
Taq DNA polymerase (1u/ àl) 0.5
Khuụn 1.0
Tổng 15.0
Hỡnh 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc cỏc khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh. Giếng1-13 là cỏc khuẩn lạc được đỏnh số tương ứng; ĐC: đối chứng õm khụng cú DNA; M: thang chuẩn 1 kb.
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chỳng tụi đó thu được 10 trong số 13 khuẩn lạc mang đoạn chốn cú kớch thước xấp xỉ 1338 bp như mong đợi. Cỏc khuẩn lạc này được kớ hiệu NK1-1 đến NK1-10.