2.2.1. Hóa chất
Poly lactic axit (PLA), Poly (-hydroxybulyrate) (PHB), poly(-caprolactone) (PCL) được mua từ hãng Sigma (Mỹ) và Takara (Nhật Bản). Các hóa chất này đều đạt độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu.
Iodonitrotetrazolium chloride (INT), chloroform (CHCl3), NaH2PO4, Na2HPO4, casein, gelatin, pepton, cao nấm men, và các hoá chất khác đạt độ tinh khiết trong phân tích.
2.2.2. Thiết bị
Nồi khử trùng (ALP–Nhâ ̣t). Máy lắc (Satorius–Đức).
Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–Ý). Máy đo mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c (Bionate–Anh). Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản).
Cân Kern (Satorius–Đức). Cân Precisa XT 220A (Ý). Tủ ấm (Sartorius–Đức).
Máy ly tâm sigma 3K30 (Memmert–Đức). Tủ sấy (Memmert–Đức).
Máy khuấy từ (IKA RET–Đức).
Máy giải trình tự tự động 3100-Avant Genetic Analyzer, AB-Applied Biosystem (Mỹ).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu 2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy vào các ống Falcon đã khử trùng. Tiến hành lấy mẫu trên cả 2 khu vực: Nhà máy xử lý rác thải Cầu diễn-Từ liêm-Hà Nội và Khu vực bãi rác Đình thôn-Mỹ đình-Từ liêm-Hà Nội. Mẫu đất được lấy ở phía dưới cách bề mặt 5-10 cm.
2.3.2. Môi trƣờng phân lập nuôi cấy 2.3.2.1. Môi trƣờng khoáng cơ bản 2.3.2.1. Môi trƣờng khoáng cơ bản
Một lít môi trường đặc bao gồm các thành phần: Cao nấm men 0,1g MgSO4 0,1g NaCl 0,1g KH2PO4 0,2g CaCl2 0,02g FeSO4 0,1g Agar 20g Nước cất 1 lít 2.3.2.2. Môi trƣờng LB Peptone 10g
Cao nấm men 5g
NaCl 10g
2.3.3. Phân lập trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 0,2% PLA 2.3.3.1. Phƣơng phá p cấy trải 2.3.3.1. Phƣơng phá p cấy trải
Môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn các bon duy nhất (20 mg PLA/1ml CHCl3).
Dùng các đĩa petri có c hứa môi trường khoáng bổ sung 0,2% PLA đã khử trùng. Dùng pipet lấy 100µl di ̣ch mẫu cho lên bề mă ̣t tha ̣ch . Dùng que cấy gạt đã vô trùng gạt đều mẫu trên bề mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khô thì dừ ng la ̣i.
2.3.3.2. Phƣơng phá p nuôi cấy lắc
5g đất của mẫu nghiên cứu được đưa vào bình tam giác dung tích 250ml, chứa 50ml môi trường muối khoáng với 0,2% thể tích PLA đã vô trùng. Các bình tam giác sau đó được lắc ở nhiệt độ 37°C, tốc độ lắc 170 vòng/phút.
2.3.3.3. Phƣơng pháp cấy điểm
Sử dụng các đĩa petri đã đựng sẵn môi trường khoáng bổ sung 0,2% PLA vô trùng. Để mặt thạch khô, dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc trong ống giống để bào tử tách ra và bám vào que cấy. Cấy một điểm trên mặt thạch của đĩa petri. Sau đó đưa các đĩa đã cấy vào tủ ấm 37°C nuôi trong 4-7 ngày. Quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc.
2.3.4. Phƣơng phá p xác đi ̣nh, nhâ ̣n da ̣ng chủng nghiên cƣ́u
2.3.4.1. Phƣơng phá p nhuô ̣m Gram
Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh . Ban đầu vi khuẩn đươ ̣c nhuô ̣m bằng tím kết t inh sau đó được xử lý bằng iôt để tăng đô ̣ giữ màu . Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày la ̣i . Do vâ ̣y phức chất tím kết tinh và iot được giữ la ̣i , vi khuẩn có màu tím . Peptidoglican ở vi khuẩ n Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn có thể loa ̣i lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thước của lỗ . Do vâ ̣y, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kế t tinh-iôt. Khi nhuộm la ̣i bằng safain thì vi khuẩn có màu hồng [1].
Phương pháp tiến hành [9]:
Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch , đốt nóng que cấy trên ngo ̣n lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc tr ên đĩa tha ̣ch hoă ̣c trong ống giống , đưa vào gio ̣t nước, cố đi ̣nh vết bôi bằng cách hơ khô trên ngo ̣n lửa đèn cồn.
Cho mô ̣t gio ̣t tím kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bôi , nhuô ̣m trong thời gian 1 phút. Sau đó rửa bằng nước cất và thấm khô.
Nhuô ̣m với lưugôn tương tự như với tím kết tinh. Rửa bằng cồn trong 30 giây. Thấm khô.
Nhuô ̣m safain trong 2 phút. Rửa bằng nước cất, thấm khô. Soi trên kính hiển vi quang ho ̣c có đô ̣ phóng đa ̣i 100 lần. Quan sát kết quả và đưa ra kết luâ ̣n. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.4.2. Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét
Mẫu vi sinh vật được xử lý trước khi soi trên kính hiển vi điê ̣n tử quét. Đánh tan mẫu vào dung di ̣ch cố đi ̣nh Glutaraldehyte trong 2 giờ
Ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Rửa tủa bằng đê ̣m CaCodylate 2 lần.
Cố đi ̣nh tế bào bằng axit Osmic (OsO4) 1% trong 1 giờ . Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C. Rửa la ̣i bằng đê ̣m CaCodylate.
Loại nướ c bằng cồn với nồng độ tăng dần lần lươ ̣t: 30o, 50o, 70o, 90o, 100o. Mỗi nồng đô ̣ trong 10 phút.
Gắn mẫu lên đế: sử du ̣ng giấy ba ̣c ta ̣o thành mô ̣t giếng trên đế , nhỏ mẫu sau khi đã khử nước bằng cồn lên giếng vừa ta ̣o.
Trung tâm Khoa học Vật liệu-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà nội.
2.3.4.3. Phƣơng pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN
Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả.
Trình tự gen 16S rARN của các chủng vi sinh vật được đọc trực tiếp trên máy phân trình tự tự động 3100-Avant Genetic Analyzer (Mỹ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
So sánh trình tự thu được với trình tự gen 16S rARN trong ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank).
Xây dựng trên cây phân loại dựa trên phần mềm Treeview.
2.3.5. Phƣơng phá p xác định hoạt độ một số enzyme ngoại bào
2.3.5.1. Xác định khả năng sinh amylase
Nguyên tắc: Amylase là enzyme có khả năng thủy phân tinh bô ̣t cho sản phẩm cuối cùng glucose bằng viê ̣c cắt đứt liên kết nô ̣i chuỗi trong ph ân tử tinh bô ̣t . Khi nhuô ̣m Lugol, những vùng xung quanh lỗ tha ̣ch có enzyme phân giải tinh bô ̣t không b ị nhuô ̣m màu, những vùng không bi ̣ thủy phân bởi amylase sẽ chuyển sang màu xanh .
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 1% tinh bô ̣t làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
làm nguồn cacbon.
Sau mô ̣t ngày nuôi cấy , ly tâm dung di ̣ch nuôi cấy 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu di ̣ch nổi.
Bổ sung vào lỗ thạch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy. Để trong tủ ấm .
Sau mô ̣t ngày đem nhuô ̣m bằng dung di ̣ch Lugol và quan sát kết quả.
2.3.5.2. Xác định khả năng sinh cellulase
Nguyên tắc : cellulase thủy phân cellulose t hành glucose . Khi nhuô ̣m Lugol , những vùng xung quanh lỗ tha ̣ch có enzyme phân giải CMC không bi ̣ nhuô ̣m màu , những vùng không bi ̣ thủy phân bởi cellulase sẽ chuyển sang màu xanh tím .
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 1% CMC làm nguồn cacbon.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủng vi sinh vâ ̣t trong môi trường khoáng có bổ sung 1% CMC làm nguồn cacbon.
Sau mô ̣t ngày nuôi cấy , ly tâm dung di ̣ch nuôi cấy 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu di ̣ch nổi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy. Để trong tủ ấm 370C.
Sau hai ngày đem nhuộm bằng dung di ̣ch Lugol và quan sát kết quả.
Để định lượng catalase người ta dùng dung dịch KMnO4 để xác định lượng H2O2 trước và sau khi enzyme tác dụng, từ đó tính được lượng H2O2 đã bị enzyme phân giải [16].
5H2O2 + 2KMnO4 + 3 H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O Sử dụng bình nón dung tích 250ml:
Bình 1: cho vào 5ml dung dịch enzyme và 10ml H2O2 0,2%. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Thêm 5ml H2SO4 10%. Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện mầu hồng bền.
Bình 2: cho vào 5ml dung dịch enzyme, đun sôi cách thủy trong 5 phút. Sau đó tiến hành các bước tiếp theo tương tự bình mô ̣t.
Tính kết quả: Số mg H2O2 bị phân giải bởi 1ml dịch chiết enzyme được tính
theo công thức sau: X = (A - B) x(1,7)
V Trong đó:
A: thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 trong bình kiểm tra.
B: thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm V: thể tích dung dịch enzym lấy để xác định
1,7: 1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 1,7mg H2O2
Số đơn vị catalase trong 1ml dịch chiết/μmol H2O2 bị phân giải sau 1 phút: Y = 30 x(X0,034) (đơn vị)
Trong đó: 30: thời gian enzym tác dụng theo đơn vị phút 0,034: 1µmol đương lượng H2O2 bằng 0,034mg.
2.3.5.4. Xác định hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. Theo phương pháp này một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn, sau 1 phút phân
giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid Trichloracetic (TCA) tương ứng với 1μmol tyrosine [16].
Cách tiến hành:
Bước 1: Lập đồ thị chuẩn tyrosine
Chuẩn bị các dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,01 đến 0,05 μmol bằng cách pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn 1 μmol với dung dịch HCL 0,2N. Lập đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein như sau: cho 1ml dung dịch tyrosine đã pha loãng vào các ống nghiệm (số ống nghiệm bằng số dung dịch tyrosine đã pha loãng ), thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem so màu ở bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Bước 2: Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống kiểm tra.
Cho vào ống thí nghiệm 0,5ml dung dịch enzym giữ ở nhiệt độ 30ºC trong khoảng 10-15 phút. Thêm vào ống 1ml dung dịch casein 2% đạt 30ºC, lắc đều và giữ ống ở 30ºC trong 10 phút. Sau đó cho ngay vào 2,5ml acid trichloracetic 5%, lắc đều, giữ trong 30 phút ở 30ºC. Lọc lấy 0,5ml dung dịch lọc cho vào 1 ống nghiệm khác, thêm 2ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt phòng rồi đem so màu với bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Đối với ống kiểm tra: cho vào nghiệm 0,5ml enzyme, sau đó cho 2,5ml acid trichloracetic 5% vào ngay, lắc đều, rồi cho thêm 1ml dung dịch casein 2%. Tiến hành các bước tiếp theo tương tự như trên.
Bước 3: Tính kết quả
Lấy hiệu số của giá trị độ hấp thụ quang giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính ra nồng độ tyrosine tương ứng.
t a
X 4
Trong đó: X: là số đơn vị hoạt động trong 1ml dung dịch enzyme
a: số µmol tyrosine tương ứ ng với hiê ̣u số giá tri ̣ mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c của ống thí nghiê ̣m và ống kiểm tra.
4: là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng t: là thời gian phản ứng (10 phút) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng phân hủy PLA 2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA 2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA sẽ tạo vòng phân hủy trên đĩa thạch có PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iodonitrotetrazolium chloride (INT), những vùng nào có mặt vi sinh vật sẽ hiện lên rõ nét với màu đỏ. INT là một chất được sử dụng để phát hiện hoạt tính của enzyme dehydrogenase có mặt trong quá trình hô hấp hiếu khí và kị khí của vi sinh vật [40]. Điện tử và hydro được tách ra từ cơ chất bởi enzym này sẽ được chuyển đến một chất nhận hydro, thường là một Co-enzym để tạo thành chất kết tinh có màu đỏ [24].
Tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủ ng vi sinh vâ ̣t trong m ôi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon.
Sau một tuần nuôi cấy, bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy của 4 chủng vi sinh vật.
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Để trong tủ ấm .
Sau 5 ngày đem nhuộm bằng INT 0,25% và quan sát kết quả. Đo vòng phân hủy PLA của các chủng vi sinh vật.
2.3.6.2. Phƣơng pháp thu hồi PLA
Nguyên tắc: Để đánh giá khả năng phân hủy PLA của các chủng vi sinh vật, tiến hành nuôi các chủng trong môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Đánh giá khả năng phân hủy PLA của chủng được nghiên cứu dựa vào lượng PLA thu hồi trong mẫu thí nghiệm và trọng lượng tế bào khô thu được [59].
Tiến hành :
Chuẩn bị môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA : cân lượng chính xác là 2g PLA cho 1 lít dung dịch khoáng có bổ sung thêm 20mg giống.
Nuôi cấy lắc ở điều kiện 370C và 170 vòng/phút.
Tiến hành thu hồi lượng PLA tại các thời điểm 10, 15, 20 ngày. Đồng thời cân trọng lượng tế bào khô thu được đến lượng không đổi.
Lượng PLA được thu hồi bằng cách ly tâm dịch nuôi cấy, thu phần cặn bao gồm PLA và tế bào.
Dùng Chloroform để hòa tan PLA trong cặn, dùng pipet tách lấy phần chất lỏng tan gồm chloroform và PLA, phần chất lỏng này để ở nhiệt độ thường chloroform sẽ bay hơi hết, đem sấy khô phần còn lại đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 70º trong 24 giờ, thu hồi được PLA.
Tế bào vi sinh vật sau khi tách PLA cũng được sấy khô đến lượng không đổi ở nhiệt độ 105º trong 6 giờ.
2.3.6.3. Phƣơng pháp tăng khả năng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Khả năng phân huỷ PLA cũng như một số các polymer sinh học khác của các chủng vi sinh vật có thể tăng lên nếu bổ sung thêm các chất cảm ứng như
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,1% các chất cảm ứng: Casein, gelatin, pepton, cao nấm men.
Nuôi cấy lắc ở điều kiện 370C và 170 vòng/phút.
Sau 3 ngày, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nghiên cứu dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm [25].
2.3.7. Phƣơng pháp tối ƣu hóa các điều kiện nhiê ̣t đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl NaCl
Mỗi chủng vi sinh vâ ̣t đều phát triển tốt nhất ở những điều kiê ̣n thích hợp . Khi nhiệt đô ̣, pH, nồng đô ̣ muối NaCl không thích hợ p sẽ tác đô ̣ng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật . Tối ưu hóa các điều kiện của chủng nghiên cứu trong môi trường có sử dụng PLA làm nguồn cơ chất duy nhất, giúp cho quá trình phân hủy PLA diễn ra nhanh và thu được lượng tế bào lớn nhất.
Chủng vi sinh v ật đươ ̣c nuôi lắc trong môi trường khoáng có bổ sung 0,2%