Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh . Ban đầu vi khuẩn đươ ̣c nhuô ̣m bằng tím kết t inh sau đó được xử lý bằng iôt để tăng đô ̣ giữ màu . Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày la ̣i . Do vâ ̣y phức chất tím kết tinh và iot được giữ la ̣i , vi khuẩn có màu tím . Peptidoglican ở vi khuẩ n Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn có thể loa ̣i lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thước của lỗ . Do vâ ̣y, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kế t tinh-iôt. Khi nhuộm la ̣i bằng safain thì vi khuẩn có màu hồng [1].
Phương pháp tiến hành [9]:
Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch , đốt nóng que cấy trên ngo ̣n lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc tr ên đĩa tha ̣ch hoă ̣c trong ống giống , đưa vào gio ̣t nước, cố đi ̣nh vết bôi bằng cách hơ khô trên ngo ̣n lửa đèn cồn.
Cho mô ̣t gio ̣t tím kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bôi , nhuô ̣m trong thời gian 1 phút. Sau đó rửa bằng nước cất và thấm khô.
Nhuô ̣m với lưugôn tương tự như với tím kết tinh. Rửa bằng cồn trong 30 giây. Thấm khô.
Nhuô ̣m safain trong 2 phút. Rửa bằng nước cất, thấm khô. Soi trên kính hiển vi quang ho ̣c có đô ̣ phóng đa ̣i 100 lần. Quan sát kết quả và đưa ra kết luâ ̣n.