+ Giai đoạn đầu là phản ứng của oxi trong không khí với polymer, các mạch polymer bị cắt nhỏ (tạo thành olygomer) là kết quả của quá trình oxi hóa, giai đoạn này không có mặt của các vi sinh vật làm nhiệm vụ oxi hóa, việc sử dụng oxi sẽ biến các mạch polymer hình thành các nhóm chức như là cacbonyl, acid cacboxilic, ester, andehid, rượu. Từ một polymer kị nước xuất hiện các nhóm chức ưa nước tạo điều kiện cho việc phân hủy các polymer dễ dàng hơn.
+ Giai đoạn hai là phân hủy sinh học bởi sự oxi hóa của các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm… chúng sẽ phân hủy các mạch olygomer còn lại thành CO2 và nước.
Trong giai đoạn đầu là giai đoạn quan trọng nhất vì nó quyết định toàn bộ quá trình, trong giai đoạn đầu của quá trình phân hủy sinh học sự giảm cấp có thể diễn ra nhanh hơn khi có mặt của tia UV hoặc nhiệt độ [67].
Bên cạnh yếu tố môi trường, cơ chế và tốc độ phân hủy polymer sinh học cũng phụ thuộc vào thành phần hóa học của polymer. Đặc biệt tốc độ phân hủy sinh học phụ thuộc vào đặc tính polymer bởi vì chúng là cơ chất cho enzym. Khả năng phân hủy polymer sinh học nhanh hay chậm phụ thuộc vào bản chất của liên kết hóa học hiện diện trong mạch polymer đó [54].
PHB và PLA có các đơn phân tương ứng là axit 3-hydroxybutyric và axit lactic. Bản chất liên kết giữa các đơn phân trong mạch polymer là liên kết este. Các liên kết này sẽ bị bẻ gẫy trong phản ứng thủy phân và gây đứt mạch polymer. Do đó cả PHB và PLA đều có thể bị phân hủy bởi các enzym thủy phân (hình 5).
Hình 5. Phản ứng thủy phân PLA [36]
Đến nay việc tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng polymer sinh học nói chung hay PLA nói riêng vẫn thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam. Việc phát hiện các chủng vi sinh vật mới không những mang lại ý nghĩa về mặt khoa học, mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc tạo ra các chế phẩm sinh học góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường.
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Các mẫu đất được thu thập từ khu vực nhà máy xử lý rác thải Cầu diễn-Từ liêm- Hà Nội và bãi rác thuộc khu vực thôn Đình thôn-Mỹ đình-Từ liêm-Hà Nội trong thời gian tháng 4/2011. Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản chuyển về phòng thí nghiệm và phân tích trong vòng 24 tiếng.
2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
Poly lactic axit (PLA), Poly (-hydroxybulyrate) (PHB), poly(-caprolactone) (PCL) được mua từ hãng Sigma (Mỹ) và Takara (Nhật Bản). Các hóa chất này đều đạt độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu.
Iodonitrotetrazolium chloride (INT), chloroform (CHCl3), NaH2PO4, Na2HPO4, casein, gelatin, pepton, cao nấm men, và các hoá chất khác đạt độ tinh khiết trong phân tích.
2.2.2. Thiết bị
Nồi khử trùng (ALP–Nhâ ̣t). Máy lắc (Satorius–Đức).
Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–Ý). Máy đo mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c (Bionate–Anh). Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản).
Cân Kern (Satorius–Đức). Cân Precisa XT 220A (Ý). Tủ ấm (Sartorius–Đức).
Máy ly tâm sigma 3K30 (Memmert–Đức). Tủ sấy (Memmert–Đức).
Máy khuấy từ (IKA RET–Đức).
Máy giải trình tự tự động 3100-Avant Genetic Analyzer, AB-Applied Biosystem (Mỹ).
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu 2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy vào các ống Falcon đã khử trùng. Tiến hành lấy mẫu trên cả 2 khu vực: Nhà máy xử lý rác thải Cầu diễn-Từ liêm-Hà Nội và Khu vực bãi rác Đình thôn-Mỹ đình-Từ liêm-Hà Nội. Mẫu đất được lấy ở phía dưới cách bề mặt 5-10 cm.
2.3.2. Môi trƣờng phân lập nuôi cấy 2.3.2.1. Môi trƣờng khoáng cơ bản 2.3.2.1. Môi trƣờng khoáng cơ bản
Một lít môi trường đặc bao gồm các thành phần: Cao nấm men 0,1g MgSO4 0,1g NaCl 0,1g KH2PO4 0,2g CaCl2 0,02g FeSO4 0,1g Agar 20g Nước cất 1 lít 2.3.2.2. Môi trƣờng LB Peptone 10g
Cao nấm men 5g
NaCl 10g
2.3.3. Phân lập trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 0,2% PLA 2.3.3.1. Phƣơng phá p cấy trải 2.3.3.1. Phƣơng phá p cấy trải
Môi trường khoáng có bổ sung PLA làm nguồn các bon duy nhất (20 mg PLA/1ml CHCl3).
Dùng các đĩa petri có c hứa môi trường khoáng bổ sung 0,2% PLA đã khử trùng. Dùng pipet lấy 100µl di ̣ch mẫu cho lên bề mă ̣t tha ̣ch . Dùng que cấy gạt đã vô trùng gạt đều mẫu trên bề mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khô thì dừ ng la ̣i.
2.3.3.2. Phƣơng phá p nuôi cấy lắc
5g đất của mẫu nghiên cứu được đưa vào bình tam giác dung tích 250ml, chứa 50ml môi trường muối khoáng với 0,2% thể tích PLA đã vô trùng. Các bình tam giác sau đó được lắc ở nhiệt độ 37°C, tốc độ lắc 170 vòng/phút.
2.3.3.3. Phƣơng pháp cấy điểm
Sử dụng các đĩa petri đã đựng sẵn môi trường khoáng bổ sung 0,2% PLA vô trùng. Để mặt thạch khô, dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào bề mặt khuẩn lạc trong ống giống để bào tử tách ra và bám vào que cấy. Cấy một điểm trên mặt thạch của đĩa petri. Sau đó đưa các đĩa đã cấy vào tủ ấm 37°C nuôi trong 4-7 ngày. Quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc.
2.3.4. Phƣơng phá p xác đi ̣nh, nhâ ̣n da ̣ng chủng nghiên cƣ́u
2.3.4.1. Phƣơng phá p nhuô ̣m Gram
Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh . Ban đầu vi khuẩn đươ ̣c nhuô ̣m bằng tím kết t inh sau đó được xử lý bằng iôt để tăng đô ̣ giữ màu . Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày la ̣i . Do vâ ̣y phức chất tím kết tinh và iot được giữ la ̣i , vi khuẩn có màu tím . Peptidoglican ở vi khuẩ n Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn có thể loa ̣i lipit khỏi thành Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thước của lỗ . Do vâ ̣y, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kế t tinh-iôt. Khi nhuộm la ̣i bằng safain thì vi khuẩn có màu hồng [1].
Phương pháp tiến hành [9]:
Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch , đốt nóng que cấy trên ngo ̣n lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc tr ên đĩa tha ̣ch hoă ̣c trong ống giống , đưa vào gio ̣t nước, cố đi ̣nh vết bôi bằng cách hơ khô trên ngo ̣n lửa đèn cồn.
Cho mô ̣t gio ̣t tím kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bôi , nhuô ̣m trong thời gian 1 phút. Sau đó rửa bằng nước cất và thấm khô.
Nhuô ̣m với lưugôn tương tự như với tím kết tinh. Rửa bằng cồn trong 30 giây. Thấm khô.
Nhuô ̣m safain trong 2 phút. Rửa bằng nước cất, thấm khô. Soi trên kính hiển vi quang ho ̣c có đô ̣ phóng đa ̣i 100 lần. Quan sát kết quả và đưa ra kết luâ ̣n.
2.3.4.2. Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét
Mẫu vi sinh vật được xử lý trước khi soi trên kính hiển vi điê ̣n tử quét. Đánh tan mẫu vào dung di ̣ch cố đi ̣nh Glutaraldehyte trong 2 giờ
Ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Rửa tủa bằng đê ̣m CaCodylate 2 lần.
Cố đi ̣nh tế bào bằng axit Osmic (OsO4) 1% trong 1 giờ . Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C. Rửa la ̣i bằng đê ̣m CaCodylate.
Loại nướ c bằng cồn với nồng độ tăng dần lần lươ ̣t: 30o, 50o, 70o, 90o, 100o. Mỗi nồng đô ̣ trong 10 phút.
Gắn mẫu lên đế: sử du ̣ng giấy ba ̣c ta ̣o thành mô ̣t giếng trên đế , nhỏ mẫu sau khi đã khử nước bằng cồn lên giếng vừa ta ̣o.
Trung tâm Khoa học Vật liệu-Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà nội.
2.3.4.3. Phƣơng pháp giải trình tự gen mã hóa 16S rARN
Nguyên tắc: Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả.
Trình tự gen 16S rARN của các chủng vi sinh vật được đọc trực tiếp trên máy phân trình tự tự động 3100-Avant Genetic Analyzer (Mỹ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
So sánh trình tự thu được với trình tự gen 16S rARN trong ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank).
Xây dựng trên cây phân loại dựa trên phần mềm Treeview.
2.3.5. Phƣơng phá p xác định hoạt độ một số enzyme ngoại bào
2.3.5.1. Xác định khả năng sinh amylase
Nguyên tắc: Amylase là enzyme có khả năng thủy phân tinh bô ̣t cho sản phẩm cuối cùng glucose bằng viê ̣c cắt đứt liên kết nô ̣i chuỗi trong ph ân tử tinh bô ̣t . Khi nhuô ̣m Lugol, những vùng xung quanh lỗ tha ̣ch có enzyme phân giải tinh bô ̣t không b ị nhuô ̣m màu, những vùng không bi ̣ thủy phân bởi amylase sẽ chuyển sang màu xanh .
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 1% tinh bô ̣t làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
làm nguồn cacbon.
Sau mô ̣t ngày nuôi cấy , ly tâm dung di ̣ch nuôi cấy 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu di ̣ch nổi.
Bổ sung vào lỗ thạch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy. Để trong tủ ấm .
Sau mô ̣t ngày đem nhuô ̣m bằng dung di ̣ch Lugol và quan sát kết quả.
2.3.5.2. Xác định khả năng sinh cellulase
Nguyên tắc : cellulase thủy phân cellulose t hành glucose . Khi nhuô ̣m Lugol , những vùng xung quanh lỗ tha ̣ch có enzyme phân giải CMC không bi ̣ nhuô ̣m màu , những vùng không bi ̣ thủy phân bởi cellulase sẽ chuyển sang màu xanh tím .
Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 1% CMC làm nguồn cacbon.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủng vi sinh vâ ̣t trong môi trường khoáng có bổ sung 1% CMC làm nguồn cacbon.
Sau mô ̣t ngày nuôi cấy , ly tâm dung di ̣ch nuôi cấy 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu di ̣ch nổi.
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy. Để trong tủ ấm 370C.
Sau hai ngày đem nhuộm bằng dung di ̣ch Lugol và quan sát kết quả.
Để định lượng catalase người ta dùng dung dịch KMnO4 để xác định lượng H2O2 trước và sau khi enzyme tác dụng, từ đó tính được lượng H2O2 đã bị enzyme phân giải [16].
5H2O2 + 2KMnO4 + 3 H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O Sử dụng bình nón dung tích 250ml:
Bình 1: cho vào 5ml dung dịch enzyme và 10ml H2O2 0,2%. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Thêm 5ml H2SO4 10%. Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện mầu hồng bền.
Bình 2: cho vào 5ml dung dịch enzyme, đun sôi cách thủy trong 5 phút. Sau đó tiến hành các bước tiếp theo tương tự bình mô ̣t.
Tính kết quả: Số mg H2O2 bị phân giải bởi 1ml dịch chiết enzyme được tính
theo công thức sau: X = (A - B) x(1,7)
V Trong đó:
A: thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 trong bình kiểm tra.
B: thể tích KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm V: thể tích dung dịch enzym lấy để xác định
1,7: 1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 1,7mg H2O2
Số đơn vị catalase trong 1ml dịch chiết/μmol H2O2 bị phân giải sau 1 phút: Y = 30 x(X0,034) (đơn vị)
Trong đó: 30: thời gian enzym tác dụng theo đơn vị phút 0,034: 1µmol đương lượng H2O2 bằng 0,034mg.
2.3.5.4. Xác định hoạt độ protease
Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. Theo phương pháp này một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn, sau 1 phút phân
giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid Trichloracetic (TCA) tương ứng với 1μmol tyrosine [16].
Cách tiến hành:
Bước 1: Lập đồ thị chuẩn tyrosine
Chuẩn bị các dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,01 đến 0,05 μmol bằng cách pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn 1 μmol với dung dịch HCL 0,2N. Lập đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein như sau: cho 1ml dung dịch tyrosine đã pha loãng vào các ống nghiệm (số ống nghiệm bằng số dung dịch tyrosine đã pha loãng ), thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem so màu ở bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Bước 2: Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống kiểm tra.
Cho vào ống thí nghiệm 0,5ml dung dịch enzym giữ ở nhiệt độ 30ºC trong khoảng 10-15 phút. Thêm vào ống 1ml dung dịch casein 2% đạt 30ºC, lắc đều và giữ ống ở 30ºC trong 10 phút. Sau đó cho ngay vào 2,5ml acid trichloracetic 5%, lắc đều, giữ trong 30 phút ở 30ºC. Lọc lấy 0,5ml dung dịch lọc cho vào 1 ống nghiệm khác, thêm 2ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt phòng rồi đem so màu với bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Đối với ống kiểm tra: cho vào nghiệm 0,5ml enzyme, sau đó cho 2,5ml acid trichloracetic 5% vào ngay, lắc đều, rồi cho thêm 1ml dung dịch casein 2%. Tiến hành các bước tiếp theo tương tự như trên.
Bước 3: Tính kết quả
Lấy hiệu số của giá trị độ hấp thụ quang giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính ra nồng độ tyrosine tương ứng.
t a
X 4
Trong đó: X: là số đơn vị hoạt động trong 1ml dung dịch enzyme
a: số µmol tyrosine tương ứ ng với hiê ̣u số giá tri ̣ mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c của ống thí nghiê ̣m và ống kiểm tra.
4: là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng t: là thời gian phản ứng (10 phút)
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng phân hủy PLA 2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA 2.3.6.1. Phƣơng pháp đo vòng phân hủy PLA
Nguyên tắc: Vi sinh vật có khả năng phân hủy PLA sẽ tạo vòng phân hủy trên đĩa thạch có PLA làm nguồn cac bon duy nhất. Khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iodonitrotetrazolium chloride (INT), những vùng nào có mặt vi sinh vật sẽ hiện lên rõ nét với màu đỏ. INT là một chất được sử dụng để phát hiện hoạt tính của enzyme dehydrogenase có mặt trong quá trình hô hấp hiếu khí và kị khí của vi sinh vật [40]. Điện tử và hydro được tách ra từ cơ chất bởi enzym này sẽ được chuyển đến một chất nhận hydro, thường là một Co-enzym để tạo thành chất kết tinh có màu đỏ [24].
Tiến hành:
Chuẩn bi ̣ đĩa tha ̣ch chứa môi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon duy nhất.
Đu ̣c lỗ tha ̣ch : 1 điểm ở giữa và 4 điểm xung quanh.
Nuôi cấy lắc chủ ng vi sinh vâ ̣t trong m ôi trường khoáng có bổ sung 0,2% PLA làm nguồn cacbon.
Sau một tuần nuôi cấy, bổ sung vào 4 lỗ tha ̣ch xung quanh 150µl di ̣ch nuôi cấy của 4 chủng vi sinh vật.
Bổ sung vào lỗ tha ̣ch ở giữa 150µl nước làm đối chứng. Để trong tủ ấm .