Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. Theo phương pháp này một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn, sau 1 phút phân
giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid Trichloracetic (TCA) tương ứng với 1μmol tyrosine [16].
Cách tiến hành:
Bước 1: Lập đồ thị chuẩn tyrosine
Chuẩn bị các dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,01 đến 0,05 μmol bằng cách pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn 1 μmol với dung dịch HCL 0,2N. Lập đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein như sau: cho 1ml dung dịch tyrosine đã pha loãng vào các ống nghiệm (số ống nghiệm bằng số dung dịch tyrosine đã pha loãng ), thêm 4ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 1ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem so màu ở bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Bước 2: Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống kiểm tra.
Cho vào ống thí nghiệm 0,5ml dung dịch enzym giữ ở nhiệt độ 30ºC trong khoảng 10-15 phút. Thêm vào ống 1ml dung dịch casein 2% đạt 30ºC, lắc đều và giữ ống ở 30ºC trong 10 phút. Sau đó cho ngay vào 2,5ml acid trichloracetic 5%, lắc đều, giữ trong 30 phút ở 30ºC. Lọc lấy 0,5ml dung dịch lọc cho vào 1 ống nghiệm khác, thêm 2ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần, lắc đều, để 30 phút ở nhiệt phòng rồi đem so màu với bước sóng 750nm. Sử dụng cuvette dày 1cm.
Đối với ống kiểm tra: cho vào nghiệm 0,5ml enzyme, sau đó cho 2,5ml acid trichloracetic 5% vào ngay, lắc đều, rồi cho thêm 1ml dung dịch casein 2%. Tiến hành các bước tiếp theo tương tự như trên.
Bước 3: Tính kết quả
Lấy hiệu số của giá trị độ hấp thụ quang giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, đối chiếu với đồ thị chuẩn, tính ra nồng độ tyrosine tương ứng.
t a
X 4
Trong đó: X: là số đơn vị hoạt động trong 1ml dung dịch enzyme
a: số µmol tyrosine tương ứ ng với hiê ̣u số giá tri ̣ mâ ̣t đô ̣ quang ho ̣c của ống thí nghiê ̣m và ống kiểm tra.
4: là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng t: là thời gian phản ứng (10 phút)