2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Phương pháp làm tiêu bản ký sinh trùng
Mỗi loài KST khác nhau tiến hành làm tiêu bản khác nhau. Đây là thao tác cuối cùng nhưng rất quan trọng.
Nguyên sinh động vật – Protozoa:
Trước khi tiến hành làm tiêu bản cần tiến hành nhuộm trùng. Đối với Protozoa
khác nhau có thể tiến hành nhuộm bằng hai cách sau:
Nhuộn bằng hematoxylin: có thể dùng để nhuộm cho tất cả các loại Protozoa
khác nhau, trừ các giống loài Cnidosporidia và Sporozoa.
Làm cho trùng no nước: ngâm trùng trong các thang cồn có nồng độ nhỏ dần: 70o, 50o , 30o,10o. Mỗi thang cồn để khoảng 10 – 20 phút.
Cho mẫu vật vào dung dịch cồn axit hoặc dung dịch Feric Sulffattamonni 2 - 4%, thời gian ngâm phụ thuộc vào từng KST: bộ tiêm mao trùng (Ciliata) ngâm 2 – 4h; bộ tiên mao trùng (Flagellata) ngâm 6 -10h.
Sau đó dùng nước cất rửa hai lần, mỗi lần 5 phút.
Ngâm trong dung dịch hematoxylin khoảng 2 – 10 phút để trùng bắt màu. Rửa qua nước 30 – 60 phút.
Nếu quá đậm màu có thể làm nhạt màu bằng cá rửa trùng qua dung dịch cồn axit hoặc Feric Sullfattamoni khoảng 6 – 8h. Khi thấy Protozoa bắt màu xanh tro hoặc màu tím thì lấy trùng ra.
Rửa qua nước chảy nhẹ 1 – 2h.
Làm mất nước: bằng cách cho trùng qua các thang cồn có nồng độ cao dần: 10o, 30o, 50o, 70o, 90o, 100o, cồn xylen (tỷ lệ 1/1), rửa qua xylen để làm trong trùng.
Gắn tiêu bản bằng bom canada.
Nhuộm bằng nitrat bạc (AgNO3) 2%: dùng thuốc nhuộm này để nhuộm trùng
thuộc các giống Trichodina; Brooklynella. Ưu điểm của phương pháp này là các vòng răng của trùng được thấy rõ, thuận lợi cho phân loại.
Xếp lamel có trùng vào khay hoặc chậu thuỷ tinh (để mặt có trùng lên trên), nhỏ nitrat bạc 2% vào đều khắp mặt lamel.
Để chậu thuỷ tinh trong bóng tối 10 phút.
Lấy mẫu ra rửa trong nước sạch nhiều lần, dựng nghiên cho khô.
Gắn tiêu bản bằng bom canada, có thể dùng glyxerin – gelatin để gắn tiêu bản nhưng với khí hậu nóng ẩm của Việt Nam rất dễ bị mốc và hỏng tiêu bản.
Sán lá đơn chủ Monogenea.
Với sán lá đơn chủ kích thước nhỏ (Dactylogyus, Pseudorhabdosynochus, Ancyrocephalus) cách làm tiêu bản rất đơn giản, sán sau khi bắt ra rửa qua nước muối sinh lý, cố định bằng cồn 70o, sau đó để khô cồn và dán bom canada.
Với sán lá đơn chủ kích thước lớn (Diplozoon, Benedenia, Neobenedenia) làm tiêu bản tương tự như sán lá song chủ.
Sán lá song chủ (Digenea) và sán lá dây (Cestoidea):
Lấy trùng ra khỏi dung dịch bảo quản.
Làm trùng no nước qua các thang cồn nồng độ nhỏ dần: 70o, 50o, 30o, 10o, 0o, ở mỗi nồng độ cồn nên để khoảng 15 – 20 phút.
Cho trùng vào dung dịch carmine hoặc hematoxylin trong thời gian từ 1 – 3h. Quan sát dưới kính hiển vi thấy tầng trung bì cơ thể trùng màu đỏ, các cơ quan bên trong có màu đỏ đậm, nhạt không giống nhau (nên nhuộm bằng hematoxylin),
Nếu bắt trùng màu quá đậm nên làm nhạt màu bằng cách nhúng trùng vào cồn axit chlorhydric.
Nhúng trùng và rửa qua nước chảy nhẹ 1h.
Làm mất nước trùng qua các thang cồn nồng độ cao dần: 10o, 30o, 50o, 70o, 90o, 100o, cồn xylen và cuối cùng là xylen (mỗi thang khoảng 15 phút).
Gắp trùng ra để khô và gắn tiêu bản bằng bom canada. Dán etyket, ghi rõ tên trùng, ký chủ, cơ quan ký sinh.
Giun tròn (Nematoda) và giáp xác (Crustacea)
Lớp Nematoda (hoặc Crustacea) không cần nhuộm và làm tiêu bản, trước khi quan sát cần ngâm trùng trong dung dịch làm trong axit lactic hoặc cồn glyxerin. Thời gian ngâm khoảng 20 phút đến 1 ngày tuỳ theo kích thước trùng, ngâm đến khi trùng trong suốt.