- H2S Di ự ộng
2.4.5. Phương pháp xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh của chủng vi khuẩn Ẹ coli và Salmonella phân lập ựược.
coli và Salmonella phân lập ựược.
2.4.5.1. Dùng phản ứng PCR ựể xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh (Yếu tố bám dắnh và ựộc tố) của chủng vi khuẩn Ẹ coli phân lập ựược.
* Các hóa chất và dung dịch cần cho phản ứng PCR - AMP ừ 5 buffer - 50 ừ TAE - Dung dịch MgCl2 stock - 0,5 M (EDTA) - dNTP stocks - Loading buffer - PCR ừ 10 buffer - Các primers:
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi và kắch cỡ sản phẩm dùng ựể xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Ẹ coli phân lập ựược.
Các yếu tố
gây bệnh Mã primer Trình tự DNA
Sta STa-1
Sta-2
5Ỗ TCT TTC CCC TCT TTT AGT CAG 3Ỗ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
STb STb-1
STb-2
5Ỗ ATC GCA TTT CTT CTT GCA TC 3Ỗ
5Ỗ GGG CGC CAA AGC ATG CTC C 3Ỗ
LT LTa-1
LTa-2
5Ỗ GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC 3Ỗ
5Ỗ CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC 3Ỗ
F4
F4-Fw F4-Rv
5Ỗ GGT GAT TTC AAT GGT TCG 3Ỗ
5Ỗ ATT GCT ACG TTC AGC GGA GCG 3Ỗ
F18
FedA-1 FedA-2
5Ỗ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC 3Ỗ
5Ỗ CIT GTA AGT AAC CGC GTA AGC 3Ỗ
VT2e VT2-Fw
VT2-Rv
5Ỗ CTT GGG TAT CCT ATT CCC GG 3Ỗ
5Ỗ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC 3Ỗ
* Chủng Ẹ coli ATCC 25922 dùng làm ựối chứng
* Cách tiến hành:
- Chu trình của phản ứng PCR: phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhaụ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và ựược thực hiện trong máy nhân gen tự ựộng Perkin Elmer, theo sơ ựồ sau:
Chu trình
thứ nhất 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Loại yếu tố gây bệnh
cần xác ựịnh Biến tắnh (0C/phút) Biến tắnh (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) F4; F5;F6;F18;F41 95/5 94/1 55/1 72/1 72/7 STa; STb; LT; VT2e 95/5 94/1 50/1 72/1 72/7
- Chạy ựiện di: Sản phẩm PCR thu ựược sau chu trình phản ứng ựược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47 ựệm TAE (Tris Ờ Agartate Ờ EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong vòng 40 phút. - Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1ộl/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trắ cố ựịnh của các nhóm có khoảng cách với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự dọ
- đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh ựèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền ựen, các ựoạn acid nicleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lạị kắch thước các băng DNA ựược so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác ựịnh ựược ựộ dài của ựoạn sản phẩm PCR.
2.4.5.2. Dùng phản ứng PCR ựể xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh (ựộc tố ựường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các chủng Salmonella phân lập ựược.
* Tách DNA:
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra ựược nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 Ờ 2 khuẩn lạc hòa vào 300 ộl nước khử ion vô trùng. đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA ựể làm phản ứng PCR. * Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kắch thước các sản phẩm PCR dùng ựể xác
ựịnh ựộc tố ựường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104 (definitive phage type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu ựã ựược công bố của các tác giả: Pritchett và cs, (2000)[87]; Cortez và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48 cs, (2006)[58]; Skyberg và cs, (2006)[92].
Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi và kắch cỡ sản phẩm dùng ựể xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ựược.
Mã primer Trình tự mồi Sản phẩm (bp) Stn- F Stn- R 5Ỗ- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3Ỗ 5Ỗ- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3Ỗ 259 InvA- F InvA- R 5Ỗ- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3Ỗ 5Ỗ- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3Ỗ 521 104SR- F 104SR-R 5Ỗ- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3Ỗ 5Ỗ- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3Ỗ 162 * Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần: - 5ộl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200ộM của mỗi loại dNTP].
- 1 ộl mỗi loại primer (3,2 ộM /ộl).
- 0,05 ộl Taq DNA Polymerase ( 5 units/ộl) (Abgene). - Nước cất vừa ựủ 25 ộl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai ựoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tắnh 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50oC/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72oC/ 7 phút.
* Chạy ựiện di:
Sản phẩm PCR thu ựược sau chu trình phản ứng ựược nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch ựệm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49 TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
*Nhuộm: Gel sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 ộl/ml) trong vòng 15 phút.
* đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ựèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kắch thước các băng DNA ựược so với DNA chuẩn (DNA marker).