2.1. Nội dung nghiên cứu:
2.1.1. Phân lập và giám ựịnh vi khuẩn Ẹ coli và Salmonellạ
- Phân lập vi khuẩn Ẹ coli và Salmonella ở lợn sau cai sữa nghi mắc bệnh tiêu chảy và bại huyết nuôi tại một số tỉnh phắa Bắc.
- Xác ựịnh một số ựặc tắnh sinh vật hóa học của các chủng Ẹ coli và
Salmonella phân lập.
- Xác ựịnh Serotype của các chủng Ẹ coli và Salmonella phân lập.
2.1.2. Xác ựịnh các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Ẹ coli và Salmonella phân lập ựược. lập ựược.
- Xác ựịnh ựộc lực của các chủng Ẹ coli và Salmonella phân lập.
- Xác ựịnh khả năng sản sinh ựộc tố của các chủng Ẹ coli và Salmonella
phân lập.
- Xác ựịnh khả năng dung huyết của các chủng Ẹ coli phân lập.
2.1.3. Cơ sở ựể chọn chủng vi khuẩn Ẹ coli và Salmonella có tắnh kháng nguyên và ựộc lực cao sử dụng chế tạo vacxin phòng bệnh cho ở lợn. nguyên và ựộc lực cao sử dụng chế tạo vacxin phòng bệnh cho ở lợn.
2.2. đối tượng, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu:
- đối tượng nghiên cứu:
đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Ẹ coli và Salmonella gây bệnh tiêu chảy và bại huyết cho lợn sau cai sữa nuôi tại các trại chăn nuôi ở một số tỉnh phắa Bắc.
- địa ựiểm nghiên cứu: đề tài ựược thực hiện tại Bộ môn Vi trùng Viện Thú y và một số tỉnh phắa Bắc như Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
2.3. Vật liệu:
2.3.1. Mẫu thắ nghiệm
Mẫu thắ nghiệm là phân và phủ tạng (gan, lách, hạch màng treo ruột, chất chứa ruột và máu tim) của lợn (3-8 tuần tuổi) ốm và chết bị tiêu chảy
có các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn Ẹ coli và Salmonella gây ra ựược nuôi tại các trại chăn nuôi tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình.
2.3.2. động vật thắ nghiệm.
Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 18-20 g/con
2.3.3. Môi trường, hóa chất, dụng cụ thiết bị thắ nghiệm.
*Các loại môi trường và hóa chất:
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ựể nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ựường ruột là những loại môi trường (của các hãng: Eiken, Oxoid, Biorad,...) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức có sẵn bao gồm:
- Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, thạch DHL, thạch TSI và môi trường Malonate, nước thịt thường, nước thịt pepton, thạch Simmons và môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng ựể ựịnh typ và giữ giống vi khuẩn
- Các loại ựường: Glucoza, Mantol, Lactoza, Sorbitol, Dextroze, Sucroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze
- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch KovacỖs, dung dịch Andrader - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
* Dụng cụ và trang thiết bi máy móc của phòng thắ nghiệm vi sinh vật.
2.3.4. Các loại kháng huyết thanh chuẩn ựể ựịnh type vi khuẩn Ẹ coli và Salmonellạ Salmonellạ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 - Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Cọ, Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng ựể ựịnh typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn
Salmonella
- Kháng huyết thanh chuẩn ựịnh type kháng nguyên O ựa giá, ựơn giá của vi khuẩn Ẹcoli và kháng huyết thanh K88, K99 chuẩn.
2.3.5. Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR.
- Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, ựệm phản ứng, ựệm ựiện di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm ựiện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide).
- Các chủng vi khuẩn dùng làm ựối chứng dương gồm: S.choleraesuis, S.typhimurium, S.enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp.
- Chủng Ẹcoli ATCC 25922 dùng làm ựối chứng
- Các chủng vi khuẩn dung làm ựối chứng dương và ựối chứng âm cho phản ứng PCR bao gồm: FD520 (F6); (09:K99); FD617 (F4); FD634 (LT STa STb K88); FD638 (LT STb K88); FD527 (negative control)
2.4. Phương pháp nghiên cứu:
2.4.1. Phương pháp lấy mẫụ