Salmonella nhược độc là vector mang kháng nguyên lạ
Nhiều nghiên cứu về khả năng của chủng Salmonella có thể tạo ra miễn dịch phòng vệ chống lại bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra (Salmonellosis) đã dẫn đến nhiều nghiên cứu khác để đánh giá tiềm năng của công cụ này trong việc biểu hiện và chuyển giao dị kháng nguyên (heterologous antigens) tới hệ thống miễn dịch. Cả Escherichia coli và một số Salmonella spp. đã được phát triển khả năng biểu hiện kháng nguyên từ đa dạng các mầm bệnh ở động vật và con người. Chủng ngừa với những vi khuẩn tái tổ hợp này có thể cảm ứng hình thành đáp ứng miễn dịch thể dịch
và trung gian tế bào đối với các kháng nguyên được biểu hiện, trong một số trường hợp bảo vệ thành công vật chủ chống lại bệnh tật. Salmonella là một trong các tế bào sinh vật được nghiên cứu về hệ gen khá toàn diện, cùng với sự phát triển của công nghệ gen đã mở ra một hướng đi rất hấp dẫn và đầy tiềm năng. Một trong những lý do Salmonella được chọn làm vector chuyển gen kháng nguyên theo đường niêm mạc là bởi chính Samonella cũng là một vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột, có khả năng chống chọi và tồn tại với điều kiện sinh lý khắc nghiệt của hàng rào miễn dịch không đặc hiệu, cũng như bởi Salmonella có cơ chế xâm nhập hiệu quả mà trong nghiên cứu vaccine đặc điểm này được lợi dụng để chuyển giao kháng nguyên. Tuy nhiên, để ngăn chặn sự hồi độc, nhiều điểm đột biến được thực hiện để giảm bớt những gen gây nguy hại, nhưng mặt trái của vấn đề này là đòi hỏi sau khi hình thành đột biến, vector
Salmonella phải thỏa được các điều kiện an toàn thử nghiệm cũng như vẫn phải mang những đặc tính vốn có. Khả năng ứng dụng của vector Samonella rất lớn, vector này
phù hợp với các tiêu chí được đưa ra đối với một vector tái tổ hợp là không có tính độc, tính gây đáp ứng miễn dịch cao, dễ dàng nuôi cấy, và giá thành tương đối thấp để sản xuất đại trà.
Các chủng Samonella sử dụng làm vector chuyển giao vaccine niêm mạc được loại bỏ hay làm giảm bớt độc tính dựa vào chủ yếu là việc tạo ra các đột biến trên các gen
38
quan trọng. Các đột biến này có thể được chai thành 3 dạng chính gồm đột biến trên gen tổng hợp, gen điều hòa và gen liên quan đến độc tính.
Đột biến trên gen tổng hợp
Việc loại bỏ một số gen tổng hợp như galE, và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp amino acid thơm và purine cho thấy có thể tạo ra chủng Salmonella nhược độc. GalE mã hóa cho enzyme UDP-galactose-4-epimerase tham gia chuyển hóa UDP- glucose thành UDP-galactose, UDP-galactose là cơ chất cho tổng hợp kháng nguyên lõi và kháng nguyên O của lipopolysaccharide (LPS), đột biến xảy ra ở galE biểu hiện ra kiểu hình xù xì khi nuôi cấy trong môi trường không có bổ sung galactose. Tuy nhiên, nếu nuôi cấy trên môi trường có bổ sung galactose với hàm lượng thấp cho kết quả kiểu hình nhẵn mịn, trong khi nồng độ galactose cao sẽ dẫn đến tế bào tự phân do sự tích tụ độc tố galactose-1-phosphate [14]. Một trong những thành công đầu tiên trong sản xuất chủngSalmonella nhược độc là đột biến trên galE của Salmonella typhi Ty2, thu nhận bằng cách xử lý chủng tự nhiên với nitrosoguanine là một tác nhân gây đột biến hiệu quả. Dòng tạo thành là Ty21a thiếu đi kháng nguyên Vi, mất đi tính độc và tạo đáp ứng miễn dịch cao khi chủng ngừa ở chuột. Thêm vào đó, Ty21a tạo ra miễn dịch nhớ kéo dài chống lại S. typhi khi đưa vào theo đường miệng trong thử nghiệm trên người. Tuy nhiên, đột biến galE via (kháng nguyên Vi âm tính) của chủng
S. typhi Ty2 vẫn có khả năng gây ra thương hàn ở người, cho thấy Ty21a cần phải được xử lý đột biến ít nhất trên một gen nữa [14].
Dòng vector nhược độc được tạo thành bằng cách loại bỏ các gen tổng hợp các amino acid thơm cũng được nghiên cứu, kết quả cho thấy dòng Samonella mang đột biến trên gen aroA, aroC và aroD tất cả đều bị làm yếu đi và có tính gây đáp ứng miễn dịch cao. Tất cả 3 đoạn gen mã hóa enzyme cần thiết cho sự tổng hợp chorismate là chất trung gian của quá trình sinh tổng hợp amino acid thơm, 2,3-dihydroxybenzoic acid và p-aminobenzoic acid (pABA). 2,3-dihydroxybenzoic và pABA đều không có sẵn ở người và lần lượt là tiền chất của enterochelin (thu hút khoáng sắt cho vi sinh vật, có vai trò quan trong trong sự sống và trao đổi chất) và acid folic. Bởi vì đột biến trên các đoạn gen này dẫn tới Salmonella mất khả năng vận chuyển sắt, làm suy giảm tính độc. Một vài đột biến trên gen aroA của S. typhimurium, S. enteritidis và S. dublin
đều cho thấy làm giảm độc lực và có khả năng bảo vệ cơ thể động vật chống lại các chủng tự nhiên nói trên khi được chủng ngừa qua đường miệng [14]. Ngoài ra, đột biến trên gen aroC hay aroD ở chủng S. typhimurium và S. typhi làm giảm được độc lực khi thử ngiệm trên chuột, và chủng S. typhi mang gen đột biến thử nghiệm hiệu quả trên người [14]. Một số thử nghiệm khác trên người với chủng S. typhi Ty2 mang
đột biến cặp trên 2 gen aroC và aroD không gây sốt thương hàn khi thử nghiệm ở người, và có thể kích thích sự tiết kháng thể IgA đặc hiệu ở ruột trên 100% người thử nghiệm với vaccine [32].
Đối với các đột biến trên gen tổng hợp như purA, purE và asd cho những kết quả kém khả quan hơn. Các enzyme mã hóa bởi purA và purE cần thiết cho việc tổng hợp
39
các purine, trong khi gen asd liên quan đến việc tổng hợp peptidoglycan và lysine.
Nhiều nghiên cứu cho thấy, S. typhimurium mang đột biến trên purA, asd hay đột biến trên cả hai gen purA và aroA hoàn toàn bị làm yếu, nhưng khả năng gây đáp ứng miễn dịch yếu, trong khi đột biến đơn trên purE không thất bại trong việc tạo ra dòng vector nhược độc. Do đó, ứng dụng của các đột biến trên gen tổng hợp purine còn nhiều hạn chế, ít có tiềm năng trong phát triển vaccine.
Đột biến trên gen điều hòa
Một giải pháp khác để tạo dòng Salmonella nhược độc được thực hiện đột biến trên các gen điều hóa những quá trình sinh tổng hợp quan trọng của tế bào, có thể là những quá trình tổng hợp độc tố. Chủng Salmonella mang đột biến trên gen phoP bị làm yếu
và mang tính kháng nguyên gây miễn dịch rất cao. Gen phoP và phoQ mã hóa cho các
protein hình thành nên hai thành phần của hệ thống điều hòa tổng hợp acid
phosphatase, các gen này rất cần thiết cho sự sinh tồn của tế bào trong đại thực bào.
Chính vì thế, việc chủng ngừa với dòng tế bào mang đột biến trên gen phoP làm giảm khả năng sống sót trong đường ruột hay ở một vài vị trí khác như gan hay lách, nguyên
nhân là do tế bào vi khuẩn đã mấtđi khả năng sống sót khi bị tiếp nhận bởi các tế bào thực bào ở đường ruột, gan và lách.
Dòng Salmonella mang đột biến loại bỏ đoạn gen cya và crp cho thấy mất đi độc tính và thể hiện khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở một vài mô hình động vật thí nghiệm. Gen cya mã hóa enzyme adenylate cyclase tham gia tổng hợp cAMP, và crp
mã hóa protein thụ thể của cAMP từ đó hình thành nên phức hợp điều hòa cAMP- CRP. Phức hợp này điều hóa biểu hiện các protein liên quan đến vận chuyển và phân giải carbohydrate và amino acid, và trong việc tổng hợp fimbriae, OmpA, glycogen,
sản xuất hydogen sulfide, hình thành tiên mao. Loại bỏ cả hai gen cya và crp đảm bảo rằng thậm chí với sự có mặt của cAMP ngoại bào thì kiểu hình của dạng nguyên thủy không thể được phục hồi [14].
Đột biến trên gen gây độc
Có rất nhiều yếu tố mang độc tính đã được xác định ở Salmonella spp., đột biến trên yếu tố này là một ừng cử viên tiềm năng trong phát triển dòng vector nhược độc ứng dụng trong vaccine. Trong khi nghiên cứu tác động của đột biến cya và crp trên
độc tính của S. cholerasuis ở chuột, đột biến mất đoạn gen crp và cysG có hoạt tình độc thấp hơn và tạo được miễn dịch phòng ngự tốt hơn so với đột biến trên cả 2 gen cya và crp, điều này cho thấy có thể một số allele bị loại bỏ ảnh hưởng tới mức độ độc tính của tế bào.
Dẫn xuất của chủng S. typhimurium mang đột biến trên gen htrA được đánh giá rất cao trong tính an toàn và khả năng tạo đáp ứng bảo vệvật chủ chống lại tác nhân xâm nhiễm theo đường miệng ở chuột [14]. Gen htrA mã hóa cho polypeptide cảm ứng bởi
stress, và đột biến này thể hiện sự nhạy cảm đối với tác nhân oxy hóa khử như
menedione và hydrogen peroxide. S. typhimurium ΔhtrA tạo ra mức độ bảo vệ tương tự như đột biến trên aroA, aroC, nhưng khả năng duy trì trong mô ở mức thấp hơn.
40
Vector không có khả năng duy trì sự tồn tại trong mô là một đặc điểm rất lý tưởng cho việc ứng dụng vaccine trên cơ thể người [14].
Các plasmid đóng vai trò rất cần thiết cho sự xâm nhiễm của S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis, S. choleraesuis, và S. gallinarum, việc mất các plasmid xảy ra đối với bất kỳ chủng nói trên đều làm giảm độc tính của chúng.
Vector biểu hiện kháng nguyên lạ
Nhiều giải pháp được đặt ra để ứng dụng vector Salmonella nhược độc một cách hiệu quả nhất. Với giải pháp sử dụng các plasmid thông dụng ở E. coli nhưng vẫn hoạt động tốt ở Salmonella spp. như ColE1, R6K, p15A và pSC101. Vấn đề gặp phải khi sử dụng plasmid trong việc biểu hiện kháng nguyên lạ chính là tính ổn định của DNA lạ trong tế bào Salmonella khi tế bào này xâm nhập vào cơ thể vật chủ, plasmid chứa gen mã hóa kháng kháng sinh và mang gen kháng nguyên đích có thể bị mất trong tiến
trình phát triển của Salmonella trong cơ thể động vật. Để tăng cường sự ổn định của
plasmid, hệ thống vector đặc biệt (balanced-lethal host vector system) chứa plasmid
mang các đoạn gen đánh dấu tổng hợp như asd, thyA hay purA, những đoạn gen này giúp duy trì sự ổn định của plasmid trong những tế bào Salmonella thuộc dòng mang
đột biến mất những đoạn gen nói trên trong nhiễm sắc thể. Một cách giải quyết khác
đó là cài nhập đoạn gen kháng nguyên đích vào bộ gen của tế bào Salmonella, với cách này có thểngăn chặn được sự mất gen kháng nguyên, tuy nhiên mức độ biểu hiện protein sẽ không cao, nhiều nghiên cứu cho thấy mức độ đáp ứng miễn dịch thể dịch và qua trung gian tế bào cũng không tốt như những kháng nguyên biểu hiện bởi plasmid [14]. Một hướng đi khác được ứng dụng để ổn định dòng tế bào vector và plasmid mang gen kháng nguyên là sử dụng các promoter được kích hoạt in vitro. Ví dụ, promoter nirB của gen tổng hợp nitrate reductase hay promoter của aerobactin
được cảm ứng hoạt động trong môi trường với điều kiện lần lượt là kỵ khí và mức thấp
hàm lượng sắt, đây cũng là điều kiện thường thấy trong các mô động vật. Promoter cũng là hướng đi được đào sâu bởi nhiều chứng cứ giả thuyết rằng đểcó được đáp ứng miễn dịch ở mô niêm mạc hiệu quả, đòi hỏi và phụ thuộc chủ yếu vào mức độ biểu hiện của protein kháng nguyên, điều này có thể giai quyết bằng cách ứng dụng các promoter mạnh, hoạt động hiệu quả trong tếbào động vật. Bên cạnh đó, một giải pháp thay thế cho việc biểu hiện toàn bộ đoạn gen mã hóa kháng nguyên, có thể chỉ cần
chèn đoạn các epitope (yếu tố quyết định kháng nguyên) vào các protein sẽ đóng vai
trò là chất mang các epitope nói trên, và các protein chất mang này sẵn sàng được mã hóa bởi Salmonella.
Vector là poliovirus
Poliovirus là thành viên của họ Picornaviridae bao gồm các thành viên không chỉ
xâm nhiễm trên người mà còn trên đa dạng các động vật thí nghiệm. Poliovirus được phân loại là một virus xâm nhập theo đường miệng có nguồn gốc từ phân, và là
41
nguyên nhân gây ra bệnh bại liệt. Trong bốn thập kỷqua đã có hai dòng vaccine chống
poliovirus được triển khai : (i) vacine poliovirus bất hoạt bằng formalin (IPV) phát triển bởi Jonas Salk, (ii) vaccine poliovirus sống, được làm yếu, sử dụng qua đường miệng (OPV) phát triển bởi Albert Sabin. Cả hai loại vaccine đều có khả năng tạo miễn dịch thể dịch chống lại bệnh bại liệt, tuy nhiên, chỉ có OPV tạo được miễn dịch tại màng nhầy mạnh và gợi đáp ứng miễn dịch tế bào. Vì vậy, tất cả vector poliovirus
đều có nguồn gốc từ chủng vaccine Sabin làm yếu. Việc lựa chọn sử dụng poliovirus
như là một vector mang gen kháng nguyên trong phát triển dòng vaccine chống lại căn
bệnh thế kỷ AIDS nói riêng và các bệnh truyền nhiễm khác nói chung có rất nhiều ưu điểm và tiềm năng ứng dụng [29]:
Như đã trình bày, một vaccine hiệu quả phải cảm ứng được miễn dịch không
đặc hiệu để từ đó kêu gọi đáp ứng miễn dịch đặc hiệu một cách hiệu quả. Và sự xâm nhiễm tự nhiên của virus là một trong những phương thức phù hợp với tiêu chí trên.
Vaccine OPV của Sabin là một trong những vaccine trên người an toàn nhất và hiệu quả nhất.
Hệ gen của poliovirus dễdàng được cải tạo thành dòng vector tái tổ hợp.
Sự hiểu biết về virus poliovirus được đút kết qua nhiều thử nghiệm và nghiên cứu cũng như ứng dụng trên người.
Vaccine với vector là poliovirus gợi được cảhai đáp ứng thể dịch và tế bào.
Vaccine poliovirus gây được đáp ứng miễn dịch ở hệ miện dịch niêm mạc cụng
như miễn dịch hệ thống.
Vaccine poliovirus tạo ra trí nhớ miễn dịch kéo dài.
Được sử dụng theo đường miệng, không cần sử dụng kim tiêm.
Quy trình sản xuất poliovirus đã được thiết lập, và virus có thể được sản xuất với quy mô lớn, giảm chi phí sản xuất.
Cấu tạo bộ gen của họ Picornavirus gồm một mạch dương RNA kích thước khoảng 7400 nucleotide bao gồm luôn cả đuôi polyadenyl ởđầu 3’. Đầu 5’ của RNA có một phân tử protein của virus gắn cộng hóa trị với phân tử RNA là VPg. Bộ gen chứa một vùng dài 743 nucleotide không được phiên mã ởđầu 5’ có chức năng như là
vị trí bám từ bên trong của ribosome (internal ribosome entry site, IRES) giúp tăng cường sự khởi động dịch mã. Vùng dịch mã gồm ba vùng nằm liền kề nhau, mỗi vùng dài 2207 nucleotide chiếm 89% tổng số nucleotide và mã hóa cho một phân tử protein dài. Phân tử protein này sẽđược trưởng thành qua hoạt động phân cắt của các protease thành các tiểu phần nhỏ hơn có hoạt động chức năng riêng biệt. Protease 3Cpro được mã hóa bởi virus nhắm vào liên kết giữa cặp amino acid glutamine-glycine. Sự phối hợp hoạt động của 3Cpro và 3Dpol (RNA polymerase) cũng có hoạt tính phân giải protein, chức năng của phức hợp 3CD chủ yếu là tạo thành vỏ capsid từ chuỗi polyprotein. Vùng dịch mã của bộ gen poliovirus có thểđược chia thành ba phần : P1,
42
P2, P3 (Hình 2.1). Vùng chứa gen mã hóa cho protein capsid là chuỗi polyprotein
được gọi là P1. Một protease nữa của virus, 2A, tự động cắt đoạn P1của chuỗi polyprotein trong tiến trình dịch mã, tiếp đó P1 gồm ba tiểu vùng VP0, VP3, và VP1
được tạo thành nhờ hoạt động của protease 3CD. Cũng trong lúc P1 được phân cắt, sự
lắp ghép hình thành poliovirus bắt đầu. Vùng P2 và P3 của bộ gen mã hóa cho các protein cần thiết cho quá trình sao chép, P3 mã hóa cho protease 3Cpro và enzyme RNA polymerase 3Dpol. Trong quá trình sao chép, mạch dương RNA đầu tiên sẽ tạo ra bản sao là mạch âm RNA bổ sung, trên thực tếở các tế bào nhiễm poliovirus phát hiện mạch âm ở mức rất thấp. Mạch âm vừa được tổng hợp sẽ làm khuỗn mẫu để tổng hợp phân tử RNA mạch dương khác [14].
Hình 2. 1: Cấu tạo bộ gen và các tiểu phần chức năng của poliovirus [14].