Hiện này, các nhà nghiên cứu vaccine đang phải đối phó với một quy luật: kháng
nguyên càng xác định và độ tinh sạch càng cao thì hoạt tính kháng nguyên kích thích hệ miễn dịch càng thấp. Điều này đúng với cả miễn dịch ngoài niêm mạc và ở niêm mạc, bên cạnh đó ở hệ thống niêm mạc, nếu kháng nguyên hoạt tính thấp như protein đơn lẻ có thể gây ra sự dung nạp miễn dịch. Nhu cầu về sự phát triển chất mang kháng nguyên có khả năng tăng cường kích thích miễn dịch và bảo vệ kháng nguyên khi chủng ngừa theo đường niêm mạc đã và đang được thúc đẩy. Trong đó, chất mang kháng nguyên có cấu trúc mô phỏng mặt ngoài của vi sinh vật gây bệnh là một giải pháp tiếp cận vấn đề trực tiếp và hợp lý. Chính vì thế, trong khoảng 10 năm ngay sau
sự mô tả bước đầu về liposome năm 1965 và cấu trúc “hạt giống virus” (virus like particle) hình thành sau khi xử lý màng bao virus với saponin năm 1973, tiềm năng
phát triển của hệ thống chất mang này trở thành đềtài được quan tâm nhiều trên các báo cáo khoa học [31]. Bên cạnh đó, mô hình ISCOM (immune stimulating
50
complexes) cũng là bước phát triển chất hỗ trợ và chuyển giao vaccine. Tuy ISCOM có cấu trúc khác với liposome, nhưng cảhai đều được đề cập chung trong mục này do cảhai đều thuộc vềđại gia đình chất mang có nguồn gốc từ lipid.
Liposome
Liposome nguyên mẫu truyền thống là bóng màng cấu tạo từ phospholipid [31]. Liposome rất dễ dàng được thay đổi thành phần, kích thước, tính chất hóa lý, và đặc
điểm miễn dịch. Điều này cho phép thay đổi các mô hình thiết kế nhằm mục tiêu đạt
được sự tối ưu về chức năng. Liposome là vừa là một dạng chất mang riêng biệt vừa là một tên gọi chung cho các dạng chất mang khác cùng thuộc họ chất mang giống
liposome như transfersome, niosome, virosome, proteosome, archaeosome hay cochleate (cấu trúc xoắn ốc).
Phospholipid là thành phần chính, ở dạng màng hai lớp, gần giống với màng sinh học của sinh vật. Tính chất hóa lý của liposome có thểđược thay đổi bằng cách thay
đổi thành phần cấu trúc của liposome. Cholesterol được bổsung vào để tăng cường độ
cứng và rắn chắc cho lớp màng đôi, tạo cho màng có tính ổn định cao. Một số tính chất bề mặt khác như điện tích bề mặt, sự nhạy cảm với pH cũng có thể thay đổi. Kích
thước của liposome nằm trong khoảng 50 nm đến vài micromet. Liposome có thể ở
dạng từng phiến đơn (unilamellar) hay dạng nhiều phiến kết hợp (multilamellar) (Hình 2.4), điều này phụ thuộc vào phương pháp tổng hợp liposome. Cơ chếcơ bản của việc tổng hợp liposome được thực hiện qua ba bước chính: (1) hydrate hóa lipid, (2) phối trộn pha không phân cực chứa lipid với pha nước, tiếp đến là sự loại bỏ dung môi hữu
cơ (thường là dung môi hữu cơ không trộn lẫn với nước), (3) hòa tan lipid bởi chất tẩy (detergent) và chất tẩy cũng được loại bõ bằng cơ chế thẩm tách (dialysis) [31]. Việc tổng hợp các liposome đơn giản ở quy mô nhỏ được thực hiện tương đối dễ dàng,
nhưng trên thực tế, ứng dung liposome làm chất mang kháng nguyên gặp phải một số khó khăn như việc nâng cao hiệu quả kết hợp với kháng nguyên, duy trì hoạt tính khi kết hợp với kháng nguyên, hay vấn đề nâng tầm quy mô sản xuất [31]
Về cơ chế hoạt động, liposome chứa các phân tử phospholipid trung tính không thật sự hiệu quả trong vai trò là chất hỗ trợ kháng nguyên [31]. Một cơ chế hỗ trợ mà
liposome được xem là có đóng góp đến hoạt động miễn dịch là khảnăng chuyển giao
kháng nguyên ưu tiên đến đại thực bào, giúp cho việc trình diện kháng nguyên dễ dàng và hiệu quả hơn. Điều này được chứng minh qua thí nghiệm hạt liposome mang dichloro-methylene-diphosphonate tạo ra sự giảm thiếu số lượng đại thực bào khi
liposome được đưa vào cơ thể theo đường tĩnh mạch [14]. Do đó, nhiều nghiên cứu
được thực hiện để thay đổi cấu trúc liposome nhằm định hướng các hạt lipid mang kháng nguyên này bám thuận lợi lên các tế bào trình diện kháng nguyên. Phương pháp đã được phát triển là tổng hợp các lipid tích điện dương, có khảnăng bám trên các tế
51
bào trình diện và các tếbào khác có màng tích điện âm. Sựtăng cường tiếp nhận bởi tế
bào trình diện kháng nguyên cũng như đáp ứng độc tế bào và thể dịch được ghi nhận trong khảo sát in vitro [31]. Ngoài ra, để sựtương tác hiệu quảhơn, các loại ligand hay kháng thể đặc hiệu với thụ thể trên tế bào trình diện kháng nguyên cũng được kết hợp với các loại liposome.
Hình 2. 4: Cấu trúc không gian của liposome. (a) hình cắt liposome phiến đơn, (b) hình cắt hạt
liposome nhiều phiến. [14]
Một số kết luận đã được rút ra về tính an toàn và hiệu quả của cấu trúc liposome.
Đầu tiên, liposome không kèm chất hỗ trợ khác có thể cải thiện đáp ứng miễn dịch thể
dịch và tế bào chống lại kháng nguyên đi kèm. Sự bổ sing chất hỗ trợ, phân tử định
hướng hay một số lipid khác có thể tạo ra sản phẩm có hiệu quả cao hơn nhưng không
gây sự tổn thương đến tế bào trong cơ thể. Thứ hai, liposome có tính an toàn cao, nhiều báo cáo thử nghiệm trên người không ghi nhận tác dụng phụ nào nghiêm trọng, một vài vaccine với liposome là chất mang kháng nguyên đang được thử nghiệm trên
người [31].
ISCOM
ISCOM là một dạng màng lipid co nhiều lỗ rỗng, thành phần gồm có phospholipid, choleaterol và saponin (Hình 2.5). Saponin là một chất hoạt động bề mặt, có tính ưa nước, cấu tạo gồm 8-10 monosaccharide liên kết hóa trị với một steroid hay một triterpene. Loại saponin được ứng dung rộng rãi nhất được biết đến với tên gọi acid quillajic (Quil A) là một triterpene chiết tách từ cây Quillaja saponaria. Cấu trúc
52
protein (có vùng kỵ nước). Với cấu trúc cơ bản nói trên, ISCOM có thể được phân thành các dạng sau:
Vaccine ISCOM truyền thống với kháng nguyên lưỡng tính được hòa nhập vào cấu trúc của ISCOM.
Vaccine ISCOME mà kháng nguyên được phối trộn và tạo tương tác với chất hỗ trợ ISCOMATRIX.
Vaccine ISCOMATRIX với kháng nguyên được trộn nhưng không tạo tương
tác với chất hỗ trợ ISCOMATRIX.
Hình 2. 5: Cấu trúc không gian của hạt ISCOM rỗng không chứa thuốc [14].
ISCOM vừa là chất mang vaccine phù hợp cho ứng dụng chuyển giao vaccine theo niêm mạc vừa có vai trò là chất hỗ trợ vaccine rất hiệu quả [31]. Một số kết luận về
hoạt tính của ISCOM đã được trình bày qua nhiều báo cáo nghiên cứu. Saponin có hoạt tính hỗ trợ, kích thích đáp ứng miễn dịch hiệu quả khi tiêm chủng ngoài niêm mạc, thậm chí cao hơn cả đáp ứng tạo ra bởi chất hỗ trợ Freund [14]. Hơn thế nữa, chủng ngừa theo đường mũi với ISCOM gợi được đáp ứng miễn dịch tế bào và phản
ứng quá mẫn muộn ở miễn dịch hệ thống. Với chủng ngừa niêm mạc, vaccine cúm
ISCOM gây được đáp ứng độc tế bào ở chuột mạnh ở mô niêm mạc cũng như ngoài
niêm mạc. Hiệu quả của đáp ứng này được đánh giá là ngang bằng hay tốt hơn cả đáp ứng thu được khi sử dụng chất hỗ trợ là độc tố ruột LT [31]. Bên cạnh đó, đáp ứng ở
mô niêm mạc khác khi tiêm chủng ISCOM theo đường mũi cũng được ghi nhận [31].
Nhìn chung, vaccine ISCOM là chất cảm ứng mạnh sự sản xuất kháng thể cũng như đáp ứng tế bào T CD4+ và CD8+, kích hoạt cả miễn dịch bẩm sinh và thích ứng. Sự chủng ngừa vaccine ISCOM ở chuột ghi nhận được sự sản xuất một số loại cytokine quan trọng như IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 và IFN-γ [31]. Bên cạnh
53
đó, một số tác dụng phụ của vaccine ISCOM cũng đã được trình bày trong một số
nghiên cứu, chủ yếu là do tác động mạnh của thành phần saponin. Một số vaccine
ISCOM và ISCOMATRIX đang được tiến hành thử nghiệm trên người để chống lại một số tác nhân gây bệnh như virus cúm, HPV.
Tổng kết lại, hệ thống chuyển giao vaccine có nguồn gốc từlipid như liposome và
ISCOM đã được giới thiệu sơ lược ở trên, hay một số dạng khác như các hệ nhũ tương
(oil emulsion) có nhiều ưu điểm và tiềm năng. Các dạng chất mang này vừa đóng vai
trò là chất chuyển giao vaccine, vừa có hoạt tính hổ trợ tốt, đặc biệt là ISCOM. Tính an toàn của các loại ISCOM và liposome đã được khẳng định qua một số thử nghiệm
lâm sang đã được báo cáo, ví dụ như hai loại vaccine ngừa viêm gan siêu vi A (Epaxal) và cúm (Infexal V) với liposome ở dạng virosome đã được chấp thuận và cho phép sử dụng trên người [31]. Tuy các nghiên cứu ứng dụng chuyển giao vaccine theo
đường niêm mạc chưa đi đến giai đoạn thử nghiệm lâm sang, nhưng đây hứa hẹn sẽ là một hướng đi tiềm năng trong tương lai.
2.2.4. Vaccine thực vật: gạo chuyển gen cảm ứng dung nạp miễn dịch trong trị liệu dị ứng tuýp 1
Việc chủng ngừa theo đường miệng đơn liều với hàm lượng cao protein kháng nguyên hay liều thấp được lặp lại nhiều lần đều có khả năng cảm ứng trạng thái dung nạp miễn dịch đường miệng từ đó dẫn đến bất hoạt đáp ứng miễn dịch hệ thống. Ở
chuột, dung nạp được tạo ra với liều lượng kháng nguyên 20 -500mg cho một lần hay 20 µg nhắc lại nhiều lần. Như đã trình bày ởchương một, sự dung nạp miễn dịch theo
đường miệng cảm ứng bởi kháng nguyên liều lượng cao gây ra hiện tượng thoái hóa dòng hay vô ứng dòng. Sự thoái hóa dòng được chứng minh do sự chết tế bào T hiệu lực phụ thuộc thụ thể Fas(CD95), còn sự vô ứng dòng xảy ra thông qua sự tương tác không đủ kích hoạt đáp ứng miễn dịch liên quan đến thụ thể CD80/86 trên các tế bào trình diện kháng nguyên và CD28 trên tế bào T [28]. Ngược lại, dung nạp cảm ứng bởi liều thấp protein ức chế hoạt động của các tế bào miễn dịch với vai trò của các tế bào T
điều hòa như nTreg CD4+ CD25+ (hay CTLA4+ Foxp3+), Tr1 (sản xuất IL-10), Th3 (sản xuất TGF-β), tếbào T điều hòa CD8+ [28]. Với những nghiên cứu và hiểu biết về
dung nạp miễn dịch qua đường niêm mạc ruột, hiện tượng này có thể được ứng dụng
để điều khiển đáp ứng dị ứng, với hướng tiếp cận là vaccine trị liệu (therapeutic vaccine). Với hướng tiếp cận truyền thống của vaccine mang tính chất phòng ngừa, vaccine sẽ hoạt động đểkích thích đáp ứng miễn dịch ở niêm mạc chống lại tác nhân gây dị ứng. Nhưng, vaccine trị liệu với mục đích kích hoạt hệ thống điều hòa ở niêm mạc đểức chếvà ngăn chặn đáp ứng với kháng nguyên dịứng.
Giải pháp chủng ngừa kháng nguyên protein cảm ứng hiện tượng dung nạp miễn dịch là một phương pháp hữu hiệu và đầy tiềm năng trong trị liệu dị ứng và các bệnh lý tự miễn khác. Về mặt ứng dụng lâm sang, một lượng rất lớn kháng nguyên đòi hỏi
54
phải được sản xuất ra phục vụ cho nhu cầu đông đảo trong dân số, bởi đểgây ra được hiện tượng dung nạp, lượng kháng nguyên cần được sử dụng phải là rất lớn. Trên nhu cầu thực tế, một phương pháp sản xuất và một hệ thống chuyển giao tân tiến đang là yêu cầu rất cấp bách. Mặc dù các tác nhân dị ứng tái tổ hợp có thể được sản bằng những quy trình tiên tiến, nhưng hiệu quảứng dụng vẫn còn nhiều hạn chế do gặp phải
khó khăn trong việc chuyển giao vaccine đến mô niêm mạc với liều lượng hợp lý. Thực vật đã được ứng dụng như là một lò phản ứng sinh học biểu hiện một số protein tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện ở thực vật có một số ưu điểm hơn so với các hệ thống biểu hiện trong nuôi cấy các tế bào prokaryote và eukaryote. Một sốđặc điểm của hệ
thống biểu hiện thực vật là chi phí sản xuất thấp hơn, quy mô sản xuất nhanh chóng
được nâng lên, sự biến đổi sau dịch mã ở thực vật tạo ra protein có cấu trúc chính xác
hơn, giảm thiếu nguy cơ xâm nhiễm các mầm bệnh ở người, chịu đựng được môi
trường enzyme tiêu hóa trong đường ruột, thêm vào đó thực vật có thể biểu hiện liên tục nhiều đoạn gen chèn vào [28]. Ngoài ra, vaccine thực vật đồng thời cũng là một hình thức chuyển giao vaccine đến niêm mạc rất đơn giản, không cần trải qua công
đoạn tinh sạch vaccine hay yêu cầu sử dụng kim tiêm như phương pháp chủng ngừa truyền thống.
Trong sốđa dạng hệ thống thực vật, chỉ một số loài cho thấy tiềm năng và hiệu quả ứng dụng trong việc sản xuất vaccine theo đường miệng như đậu nành, ngô, lúa mì và gạo bởi một số chỉtiêu được liệt kê trong Bảng 2.3. Mặc dù ngô được xem là hệ thống biểu hiện và sản xuất vaccine kháng kháng nguyên từ độc tố vi khuẩn rất hữu dụng,
nhưng nhược điểm lớn nhất của ngô là tính chất di chuyển xa của hạt phấn trong mùa thụ phấn, từđó dưới ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh có nguy cơ gây ra việc thất lạc giống chuyển gen. Đối với lúa mì, cho đến hiện nay hệ thống vector trên lúa mì vẫn còn gặp nhiều khó khăn trong việc chuyển và biểu hiện các gen kháng nguyên, mặc dù lúa mì cũng là loài thực vật theo vụ mùa được trồng trọt ở quy mô rất lớn. Chính vì hạn chế của nhiều hệ thống khác, gạo đang là sự lựa chọn được ưu tiên trong
các ứng dụng về vaccine thực vật. Cây lúa gạo và ngô đều thuộc loài thực vật tự thụ
phấn, tuy nhiên hạt phấn cây lúa có đặc điểm di chuyển với khoảng cách rất gần, chỉ
khoảng vài mét [28]. Ngoài ra, hạt gạo chứa vaccine có thể bảo quản hơn 18 tháng ở
nhiệt độ thường mà không ảnh hưởng đến hoạt tính gây miễn dịch của kháng nguyên,
điều này cho phép việc quản lý, phân phối, bảo quản và sử dụng vaccine mà không cần kim tiêm cũng như trữ lạnh. Những đặc điểm trên đều khẳng định rằng việc sử dụng gạo làm công cụ biểu hiện và chuyển giao vaccine là một giải pháp có tính thực tiễn và hiệu quả kinh tế cao, phục vụ tốt cho nhu cầu rất lớn của con người trong công cuộc phòng ngừa và trị liệu các bệnh truyền nhiễm và dịứng [28].
55
Bảng 2. 3: Tiềm năng ứng dụng vaccine trị liệu từ thực vật (cụ thể là gạo) [28].
Bảng 2.1: Tiềm năng ứng dụng vaccine trị liệu từ thực vật (cụ thể là gạo) [28].Chi phí sản xuất thấp
Quy mô sản xuất dễdàng, nhanh chóng được nâng lên Nhiều vaccine có thểđược sản xuất cùng lúc
Khảnăng chịu được sự tiêu hóa của enzyme trong đường ruột Không cần giữ lạnh trong suốt quá trình phân phối và bảo quản Có thể tự chủng ngừa, không cần sự trợ giúp chuyên môn
Không đòi hỏi công đoạn tinh sạch
Giảm thiểu tạp nhiễm các mầm bệnh ở người trong quá trình sản xuất vaccine
Loại trừ truyền nhiễm bệnh tật qua đường máu do tái sử dụng kim tiêm Loại bỏ chi phí cho kim tiêm
Bệnh dị ứng phấn hoa cây tuyết tùng ở Nhật Bản là bệnh theo mùa phổ biến ở
Nhật, gần 20% người dân ở Nhật mắc phải gây ra triệu chứng viêm mũi, viêm màng kết. Hai yếu tố kháng nguyên là Cry j 1 và Cry j 2 đã được phân lập từ phấn hoa, và
đoạn gen mã hóa cho yếu tố quyết định kháng nguyên đặc hiệu cho tế bào T cũng đã
được xác định. Để xác định hiệu quả của vaccine trị liệu, hai đoạn gen Crp1 mã hóa cho Cry j 1 và Crp2 mã hóa cho Crp j 2 được chèn vào vector pGPTV-35S-HSP, sau
đó được chuyển vào bộ gen của hạt gạo nhờ trung gian là Agrobacterium [28]. Mức tích lũy của cả hai loại protein kháng nguyên có thể đạt tới 7 µg/hạt trong hạt gạo (chiếm 0.5% tổng protein của hạt gạo) [28]. Chuột thử nghiệm được cho ăn với 2 µg
peptide được biểu hiện trong gạo (tương đương với 200 mg khối lượng bột gạo) mỗi ngày liên tục trong 4 tuần, chủng ngừa theo đường hệ thống với kháng nguyên protein nguyên vẹn của phấn hoa cây tuyết tùng để kiểm chứng sự hình thành dung nạp miễn dịch ức chế sự sản xuất kháng thểđặc hiệu IgE và IgG trong máu. Các kết quả báo cáo
thu được đều cho thấy gạo vaccine biểu hiện các epitope đặc hiệu bởi tế bào T có thể