Cấu tạo độc tố Cholera (Cholera toxin, CT) gồm hai tiểu đơn vị A và B. Tiểu đơn vị A (CT-A) là phần mang độc tố, là một protein khối lượng 28 kDa, tham gia vào
32
phản ứng ribosyl hóa ADP của protein Gs trong phức hợp enzyme adenylate cyclase nằm trên màng ở bề mặt hướng vào các mô niêm mạc (basolateral surface) của các tế bào biểu mô ruột. Tiểu đơn vị A sau khi dịch mã được cắt thành hai đơn vị nhỏ hơn là
A1 và A2, trong đó A1 là phần mang hoạt tính của enzyme, A2 là chuỗi peptide dạng α-helix gắn kết A1 và tiểu đơn vị B. Tiểu đơn vị B của độc tố Cholera (CT-B) là một pentamer đồng dạng gồm 5 tiểu đơn vị giống nhau tương tác với nhau bằng các liên kết phi hóa trị hình thành tiểu đơn vị B với kích thước 11.6 kDa tạo ra một cấu trúc dạng vòng với lỗ trung tâm là vị trí tiểu đơn vị A2 gắn xuyên qua để cố định 2 phần A và B với nhau. Tiểu đơn vị B có khả năng bám đặc hiệu trên GM1
(monosialoganglioside) là phân tử biểu hiện trên màng của hầu hết các tế bào có nhân,
bao gồm bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột, đây là mục tiêu tấn công khi độc tố xâm nhập vào cơ thể. Độc tố Cholera được thực bào ở mặt tiếp xúc với khoang tiêu hóa bởi các tế bào hấp thu ở ruột và qua nhiều bước theo các bóng màng, độc tố được vận chuyển tế bề mặt bên dưới và tương tác với phức hợp adenylate cyclase. Vị trí chính xác nơi xảy ra tương tác giữa A1 và phân tử Gs vẫn chưa được biết rõ. Việc đưa độc tố Cholera vào bên trong tế bào theo cơ chếthực bào có thể xảy ra ở rất nhiều loại tế bào khác nhau kể cả các tế bào neuron thần kinh và các tế bào lympho, trong đó việc bám tiểu đơn vị B lên màng tế bào là bước cần thiết cho quá trình thực bào [14].
Trong vai trò là một kháng nguyên, độc tố Cholera được xem là một trong những kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh nhất theo con đường niêm mạc, bao gồm đáp ứng kháng thể S-IgA rất mạnh, cộng với đáp ứng kháng thể IgG trong máu sau khi chủng ngừa theo đường miệng [14]. Trái ngược với hầu hết kháng
nguyên là protein, việc tiếp xúc với kháng nguyên là độc tố Cholera theo đường miệng hay đường niêm mạc nói chung không gây ra hiện tượng dung nạp miễn dịch (đối với đáp ứng kháng thể). Điều này được thể hiện trong một nghiên cứu về khả năng gây đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào và phản ứng quá mẫn muộn (DTH), kết quả cho thấy độc tố Cholera chủng ngừa theo đường miệng trước khi kháng nguyên thứ hai được đưa vào ở phương pháp tiêm chủng truyền thống thì ghi nhận được hiện tượng dung nạp đối với đáp ứng DTH của kháng nguyên thứ 2 nhưng không dung nạp đối với đáp ứng kháng thể do độc tố Cholera gây ra [27]. Độc tố này còn có đặc điểm cảm ứng được đáp ứng miễn dịch nhớ khi được tiêm chủng ở nhiều vị trí niêm mạc khác nhau trong một số nghiên cứu. Một số nghiên cứu khác nhấn mạnh khả năng gây đáp ứng mạnh của độc tố Cholera ở các vị trí khác nhau theo đường niêm mạc nhưng đáp ứng mạnh nhất tại vị trí độc tố trực tiếp được chủng ngừa [14]. Những đặc điểm kháng nguyên của độc tố Cholera được tóm tắt bên dưới (Bảng 2.1) cho thấy độc tố Cholera là một kháng nguyên mạnh, và những đặc điểm này được xem là có liên quan đến hoạt động như chất hỗ trợ hiệu quả cho vaccine niêm mạc.
33
Bảng 2. 1: Đặc điểm của độc tố cholera trong vai trò một kháng nguyên niêm mạc (mucosal immunogen) [14].
Kích thích đáp ứng kháng thể tiết IgA ở mô niêm mạc và đáp ứng IgG trong
máu
Không cảm ứng dung nạp miễn dịch đối với đáp ứng kháng thể
Cảm ứng mạnh miễn dịch nhớ ở mô niêm mạc
Vị trí niêm mạc được chủng ngừa là nơi có đáp ứng miễn dịch mạnh nhất
Phụ thuộc tế bào T CD4+, cảm ứng đáp ứng chủ yếu theo hướng Th2
Trong vai trò một chất hỗ trợ vaccine niêm mạc
Tác động hỗ trợ của độc tố Cholera lần đầu được đề ra trong một nghiên cứu có tính chất kiểm định độc tố này có gây ra hiện tượng dung nạp miễn dịch hay không.
Trong nghiên cứu này, độc tố được đưa vào chuột theo đường tiêu hóa dạng đơn hay kết hợp với một protein kháng nguyên khác là KLH, kết quả cho thấy độc tố Cholera không cảm ứng dung nạp đối với chính nó, và hỗn hợp độc tố và KLH có thể loại trừ tính dung nạp vốn có của KLH. Ngoài ra, độc tố Cholera còn tạo được đáp ứng kháng thể SIgA đối với KLH, việc này không xảy ra khi KLH được đưa vào riêng lẻ [15].
Một số đặc điểm khi sử dụng độc tố Cholera được đút kết bên dưới (Bảng 2.2).
Bảng 2. 2: Đặc điểm sử dụng của độc tố cholera [14].
Liều lượng thường ở mức µg dao động từ 1 đến 10 µg/liều
Con đường chủng ngừa phải là niêm mạc
Thời điểm chủng ngừa cùng lúc với kháng nguyên chính
Độc tố dạngtự nhiên (wild cholera toxin) hoạt động tốt nhất ở chuột
Đối tượng chủng ngừa có thể là các loài gặm nhắm (chuột, thỏ, chồn…), con
người
Miễn dịch nhớ kéo dài đối với tế bào B và T
Loại kháng nguyên sử dụng đa dạng từprotein tới lipid, hay các carbohydrate
Có thể sử dụng độc tố và kháng nguyên đích ở dạng phối trộn, phức hợp liên kết, phân tử tái tổ hợp.
Ngoài ra, độc tố Cholera còn có một số đặc điểm khác như :
Độc tố Cholera và Cholera B không cảm ứng dung nạp miễn dịch đối với chính
nó. Độc tố Cholera có thể ngăn chặn sự dung nạp miễn dịch đối với kháng nguyên đi
kèm [15].
Độc tố Cholera dạng nguyên thể có thể làm chất hỗ trợ đối với kháng nguyên là
độc tố tiểu đơn vị Cholera B. Độc tố Cholera B lại có thể làm chất mang cho hapten
34
Độc tố Cholera không gây đáp ứng miễn dịch kháng thể đối với các kháng nguyên từ thức ăn khi cùng hiện diện trong ruột ở thờiđiểm tiêm chủng [14].
Hoạt tính hỗ trợ của độc tố dường như liên quan và phụ thuộc chặt chẽ với hoạt tính kháng nguyên của chính nó [14]. Các dạng đột biến trên độc tố tạo ra các dòng độc tố dạng A, B đột biến, thiếu đi hay làm giảm hoạt động của enzyme và khả năng bám đều cho kết quả đáp ứng miễn dịch rất thấp.
Khả năng ứng dụng của độc tố trên cơ thể người còn rất hạn chế, do độc tố dạng tự nhiên gây ra bệnh lý tiêu chảy nghiêm trọng, cần có những nghiên cứu làm giảm độc tính đủ để có thể ứng dụng một cách hiệu quả trên cơ thể người.
Vị trí hoạt động của độc tố khác nhau ở từng mô niêm mạc khác nhau, và hiệu quả của từng dạng độc tố ở các vị trí mô niêm mạc khác nhau cũng khác nhau. Ví dụ như trong một số nghiên cứu, kháng nguyên kết hợp với độc tố Cholera B là một chất hỗ trợ hiệu quả theo đường mũi (intranasal) nhưng lại tỏ ra không hiệu quả khi được đưa vào theo đường miệng [14].
Sự tương tác với lớp tế bào biểu mô cũng khác nhau ở dạng độc tố, khả năng tiến sâu vào bên trong tế bào của độc tố Cholera dạng tự nhiên cao hơn dạng độc tố tiểu đơn vị B. Một nghiên cứu lại cho thấy khả năng hỗ trợ tuyệt vời của độc tố Cholera trong những hạt cầu lipid, mặc dù độc tố bị nhốt trong hạt cầu không tiếp xúc trực tiếp với tế bào biểu mô [14]. Nhiều cơ chế hỗ trợ khác nhau của độc tố cần nghiên cứurõ hơn để có khai thác triệt để ưu điểmcủa độc tố.
Về phương diện cơ chế miễn dịch, độc tố Cholera tác động khác nhau lên từng tế bào gồm các tế bào hàng rào biểu mô, tế bào trình diện kháng nguyên, tế bào T, B.
Dựa vào sự phân loại tác dụng của độc tố Cholera lên các loại tế bào khác nhau mà có thể tổng hợp thành 5 cơ chế hoạt động của độc tố trong vai trò một chất hỗ trợ kháng
nguyên (Hình 2.1) [14].
Thứ nhất là tăng cường sự tiếp nhận cả độc tố và kháng nguyên đi kèm, dựa vào tiểu đơn vị B có tính chất bám dính trên các phân tử GM1.
Thứ hai là tăng cường sự trình diện kháng nguyên bởi các tế bào APC ở mô niêm mạc. Các nghiên cứu cho thấy mặc dù độc tố Cholera và độc tố Cholera B không tác động làm thay đổi tính chất của các đại thực bào, độc tố có thể kích thích sản xuất
IL-1 in vitro, chính cytokine này tăng cường hoạt động của các đại thực bào trình diện kháng nguyên theo con đường MHC lớp II. Bên cạnh IL-1, độc tố còn cho thấy kích thích sản xuất IL-6 và tăng cường mức biểu hiện phân tử bổ thể B7, là tín hiệu kích hoạt tế bào T.
Thứ ba là tăng cường sự hoạt hóa tế bào T CD4 theo hướng Th2, cả độc tố Cholera va Cholera B đều không tác động lên tế bào T, mà chủ yếu là thông qua việc kích thích các đại thực bào và tạo ra môi trường có các cytokine hỗ trợ như IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 và IFN-γ. Tuy nhiên, việc kích hoạt tế bào T CD4 theo hướng Th1 hay Th2
35
bởi độc tố Cholera còn nhiều tranh cãi do có nhiều kết quả nghiên cứu trái ngược
nhau.
Thứ tư là với hàng loạt cytokine được kích thích sản xuất, trong đó có IL-4 tăng cường quá trình tái tổ hợp gen chuyển sang lớp kháng thể IgG1, và IL-5 cho lớp kháng thể IgA.
Cuối cùng là sự tương tác với các tế bào T CD8 nằm rải rác xung quanh lớp biểu mô, độc tố có khả năng ức chế hoạt động của các tế bào này bởi đây là các tế bào sản xuất ra các cytokine ức chế gây ra sự dung nạp miễn dịch khi kháng nguyên tiếp xúc riêng lẻ với mô niêm mạc. Nhờ cơ chế này mà hiện tượng dung nạp được loại bỏ và đáp ứng miễn dịch được kích hoạt đối với kháng nguyên này khi đi kèm với độc tố
Cholera.