Vật liệu sử dụng trong khảo sát gồm ba loại polymer là: poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), và copolymer ở dạng poly(ε-caprolactone-co-ethylene glycol) (PCL-PEG). Việc sử dụng ba loại polymer trên với mục đích:
PLGA được chọn bởi đặc tính phân hủy sinh học có thể điều khiển, tính thích nghi sinh học cao, đồng thời là loại polymer được chấp thuận bởi FDA về tính an toàn [21].
PEG là một loại polymer ái nước, làm giảm tính kỵnước của PLGA.
Việc sử dụng PCL trong thành phần copolymer PCL-PEG nhằm ba mục đích:
(i) tận dụng tương tác đẩy của PEG để tạo ra tính ổn định cao hơn cho hạt nano trong
môi trường dịch bào; (ii) tăng cường hấp thu bởi tế bào M in vitro [21]; (iii) cho phép gắn phân tửđịnh hướng mục tiêu là tế bào M lên bề mặt hạt nano.
Một vài đặc điểm của quan trọng của các loại vật liệu được thể hiện trong Bảng 3.3.
70
Hạt nano được chuẩn bị bằng phương pháp bốc hơi dung môi hệ “nước trong dầu
trong nước” có cải tiến [21]. Hạt nano được cấu tạo với PLGA hình thành nên phần lõi của chất mang. Copolymer lưỡng tính chứa PEG nhằm ổn định hạt nano, tăng cường tiếp nhận bởi tế bào M. Sựthay đổi thành phần của các loại polymer cũng được khảo sát trong nghiên cứu, với ba công thức được sử dụng trong Bảng 3.4. Bởi việc gắn phân tử ligand của tế bào M lên PLGA-PEG gặp nhiều khó khăn do sự không ổn
định về tính chất hóa học, nên PCL-PEG được chọn để bổ sung vào thành phần. Dựa vào kết quả nghiên cứu trước của cùng nhóm tác giả, công thức A được sử dụng với
50% PEG được bổ sung. Nhằm cải thiện hơn tính ổn định và khảnăng cốđịnh ligand, PCL-PEG được sử dụng trong công thức B và C. Công thức B được thành lập với 10% PCL-PEG vả 45% PLGA-PEG do đặc điểm chỉ số phân tán thấp hơn. Công thức C
được thành lập với 30% PEG tổng cộng bởi giả thuyết tính chất cản trở không gian trên bề mặt càng thấp thì càng thích hợp cho việc cốđịnh phân tử ligand [21].
Bảng 3. 3: Mô tả tính chất hóa học của các polymer [21].
Polymer Mn (SEC) g/mol Mn (NRM)g/mol % mol glycolide Chỉ số phân tán PDI PLGA PLGA đánh dấu huỳnh quang PEG-b-PLGA PCL-b-PEG PCL-b-PEG 22,000 23,600 29,300 22,400 26,300 4600- 16,500(L)/4700(G) 4600-15,200 6000-21,200 25 29 26 1.8 1.6 1.7 1.15 1.15
Bảng 3. 4: Thành phần (% khối lượng) các polymer trong các công thức khảo sát [21]. Công thức PLGA 22,000 PLGA-PEG 21,500-5000 PCL-PEG 15,000-5000 A B C 50 45 70 45 15 50 10 15
Các công thức A, B, C được đánh giá các tính chất vềkích thước, chỉ số pahn6 tán
kích thước, điện thế zeta và hiệu quả vi bao protein kháng nguyên thử nghiệm (ovalbumin). Nhìn chung, hạt nano với các công thức khác nhau với kích thước xung quanh 200nm, phù hợp với kích thước tối ưu cho việc hấp thu bởi mảng Payer. Bên cạnh đó, chỉ số phân tán nhỏhơn thể hiện tính đồng nhất của hệkeo, điện thế zeta của các công thức đều giảm về gần trung tính nhờ sự hiện diện của mạch PEG. Ngoài ra,
71
tính chất hạt nano theo công thức C với ligand RGD đã cố định cũng được thể hiện trong Bảng 3.5. Cuối cùng, kết quảvi gói đạt hiệu quảtương đối 30-50%.
Bảng 3. 5: Tính chất hóa lý của hạt nano tạo thành từ các công thức khảo sát [21].
Công thức A Công thức B Công thức C Công thức C - RGD Kích thước (nm) Chỉ số phân tán Điện thế zeta Hiệu quả vi gói (%) 208 ± 20 0.152 -6.6 ± 1.2 50 ± 6 200 ± 22.5 0.166 -6.8 ± 4.2 30 ± 2 201 ± 24 0.170 -9.1 ± 5.8 40 ± 1 211 ± 2.89 0.169 -13.8 ± 4.3 40
Để kiểm tra khả năng bảo vệ của chất mang đối với protein kháng nguyên trong
đường ruột, mô hình thí nghiệm được thiết kế nhằm đánh giá tính ổn định của vi hạt mang phân tử ovalbumin mang đồng vị phóng xạ [3H] trong môi trường mô phỏng dịch dà dày (HCl 0.1N) và dịch ruột (FaSSIF). Kết quả thể hiện trên Đồ thị 3.1. Sau 2 giờ ủ trong môi trường HCl 0.1N, ít hơn 5% ovalbumin được thu hồi trong dịch nổi sau ly tâm thu nhận hạt nano, và kích thước hạt nano vẫn duy trì mức ổn định trong
môi trường mô phỏng dịch dạ dày. Sau 6h ủ trong FaSSIF, kích thước hạt nano không bị thay đổi, sự giải phóng ovalbumin tăng nhẹ, nhưng vẫn ít hơn 10% trong thời gian thí nghiệm đối với công thức B và C. Tuy nhiên, sự tác động mạnh hơn của môi
trường lên công thức A được ghi nhận với 20% ovalbumin được xác định bị giải phóng trong một giờ đầu thí nghiệm, sau đó lượng phóng thích duy trì ở mức ổn định trong suốt thời gian còn lại. Bên cạnh đó, tính ổn định của hạt nano gắn RGD cũng được khẳng định (dữ liệu không trình bày). Kết quả khảo sát rút ra được kết luận rằng cả ba công thức đều thích hợp ứng dụng chuyển giao vaccine theo đường miệng: ovalbumin vẫn duy trì bên trong chất mang khi tiếp xúc với môi trường mô phỏng dịch dạ dày, ruột [21].
3.2.2. Tổng hợp và định tính hạt nano gắn phân tử RGD
Phân tử peptide RGD là ligand của thụ thể β1 integrin trên bề mặt tế bào M, việc cốđịnh RGD lên bề mặt hạt nano giúp định hướng mục tiêu cho hạt nano được hấp thu bởi tế bào M. Ligand RGD được cố định trên bề mặt hạt nano bằng kỹ thuật “photografting”, chủ yếu tương tác với phần PEG trong copolymer PCL-PEG [21].
Đầu tiên copolymer được dẫn xuất hóa tạo ra nhóm chức hoạt động có khả năng tạo liên kết với đầu không chứa amine của peptide. Ester N-hydroxysuccinimidyl (NHS)
được chọn để chèn vào copolymer PCL-PEG với O-succinimydyl 4-(p-azidophenyl) butanoate là tác nhân tạo liên kết. Dưới tác dụng của tia UV, tác nhân tạo ra gốc nitrene hoạt hóa cao có thể tạo ra phản ứng chèn vào mạch C-H của copolymer, trong
72
khi đó, nhóm chức của NHS không bịảnh hưởng. Tiếp đến, PCL-PEG với nhóm NHS hoạt hóa được xử lý với dung dịch 1mM peptide trong 24 giờ.
Những bước xử lý sau đó như rửa, sấy được thực hiện để thu được kết quả là copolymer PCL-PEG-g-GRGDS [21]. Sản phẩm sau khi gắn ligand được kiểm tra phổ quang điện tử bằng tia X (X-Ray photoelectron spectroscopy, XPS), để khẳng định kết quả. Kết quảphân tích XPS như sau:
PCL-PEG-g-GRGDS: O 1s (22.65%), N 1s (0.98%), C 1s (73.66%), Si 2p (2.71%)
PCL-PEG: O 1s (23.69%), C 1s (71.54%), Si 2p (4.78%).
Thành phần các nguyên tố bề mặt của vật liệu cho thấy sự hiện diện của nguyên tố
Nitrogen (N1s/C1s = 1.33*10-2), trong khi không xác định được peak nào của nguyên tố N1s trong mẫu PCL-PEG (mẫu đối chứng này được xử lý tương tựnhưng không có
tác nhân chèn mạch). Kết quả khẳng định phân tử peptide RGD đã được cố định trên copolymer PCL-PEG. Phức hợp PCL-PEG-g-GRGDS được tiếp tục tiến hành tạo hạt nano với vật liệu polymer chính là PLGA, theo công thức C.
Đồ thị 3. 1: Thử nghiệm đánh giá tính ổn định của hạt nano trong môi trường mô phỏng dịch dạ
dày HCl 0.1N (A), dịch ruột FaSSIF (B). Khảo sát hai yếu tố: kích thước trung bình hạt nano
(nét đậm), và lượng ovalbumin giải phóng khỏi chất mang (nét đứt). Ký hiệu: công thức A (◊),
công thức B (□), công thức C (Δ). [21]
Trong thí nghiệm này, công thức C (PLGA/PLGA-PEG/PCL-PEG 70:15:15) được chọn để nghiên cứu tác động của việc gắn phân tử RGD lên bề mặt hạt nano định
73
hướng đến tế bào M. Đầu tiên, theo kết quả trong Bảng cho thấy sự hiện diện của ligand trên bề mặt hạt nano không làm thay đổi tính chất hóa lý của hạt, ngoại trừ có sự tăng nhẹ kích thước, hiệu quả vi bao, điện thế zeta và chỉ số phân tán kích thước không thay đổi. Tính ổn định của hạt nano gắn RGD cũng được khảo sát (dữ liệu không trình bày), và kết quảlà môi trường mô phỏng dịch dạ dày- ruột không tác động
đến kích thước hạt và không có sự giải phóng ovalbumin [21].
Thành phần hóa học của bề mặt hạt nano cũng được tiến hành khảo sát nhằm khảng
định sự hiện diện của ligand. Phương pháp phân tích phổquang điện tử bằng tia X cho kết quảnhư sau:
Hạt nano-RGD: Na 1s (1.29%), O 1s (31.50%), N 1s (0.16%), C 1s (63.70%), Cl 2p (2.08%), Si 2p (1.28%).
Hạt nano: Na 1s (2.42%), O 1s (31.80%), C 1s (60.40%), Cl 2p (4.10%), Si 2p (1.28%).
Nguyên tố nitrogen được xác định trên bề mặt hạt nano chứa PCL-PEG-GRGDS (N1s/C1s = 0.25*10-2), nhưng không phát hiện trên bề mặt hạt nano “blank” đối chứng. Tín hiệu nitrogen là do sự cố định hóa trị peptide RGD lên bề mặt hạt nano. Kết quảnày được khẳng định thêm nữa với thí nghiệm xác định đoạn mồi đánh dấu cố định bằng cùng phương pháp như trên [21].
3.2.3. Kết quả chuyển giao hạt nano in vitro
Để đánh giá khảnăng ảnh hưởng của các công thức đến khảnăng vận chuyển đến tế bào M, mô hình tế bào biểu mô liên kết với nang lympho (FAE) ởngười được thiết kế. Kết quảđồng nuôi cấy tế bào Caco-2 và tế bào Raji cho kết quả mô hình FAE [31], quy trình tiến hành theo Hình 3.2.
Hình 3. 2: Mô hình nuôi cấy hình thành tế bào FAE in vitro [31].
Các thí nghiệm khảo sát sự vận chuyển hạt nano được thực hiện trên cả mô hình nuôi cấy đơn (tế bào Caco-2) và đồng nuôi cấy (Caco-2 và Raji), và được tiến hành so
74
sánh với nhau. Kết quả thể hiện trên Đồ thị 3.2. Công thức A tạo ra hạt nano có khả năng vận chuyển rất cao, nhưng không có sự khác biệt đáng kể giữa mô hình nuôi cấy
đơn và đồng nuôi cấy, cho thấy cơ chế vận chuyển không đặc hiệu. Sự vận chuyển hạt
nano trong môi trường đồng nuôi cấy tăng gấp 4 lần (ở công thức C) và 10 lần (ở công thức B) so với môi trường nuôi cấy đơn tế bào Caco-2 [21]. Bên cạnh đó, tác động độc tế bào ở các công thức cũng được khảo sát dựa trên việc đo hoạt tính của lactate dehydrogenase giải phóng từ cytosol của các tế bào bị tổn thương bằng bộ kit BioGeneTM [21]. Kết quảthu được khẳng định hạt nano theo 3 công thức đều không có
tính độc tế bào với hàm lượng được sử dụng trong khảo sát [21].
Đồ thị 3. 2: Kết quả so sánh sự vận chuyển hạt nano (công thức A, B, C) qua mô hình nuôi cấy
đơn và đồng nuôi cấy. Hạt nano sử dụng với hàm lượng 2.7*1010 hạt/ml. Papp (cm/s) là hệ số đánh giá khảnăng thấm qua tếbào được đo bằng phương pháp “fly cytometry” [21].
Tiếp theo, sự biểu hiện các thụ thể β1 và α5β1 integrin trên mô hình FAE ở trên
được khảo sát nhằm chuẩn bị cho thí nghiệm đánh giá sự vận chuyển hạt nano định
hướng bởi protein RGD là ligand phổ biến của các thụ thể trên. Hình 3.3 mô tả kết quả
chuyển đổi tế bào Caco-2 thành mô hình tế bào M in vitro với sự biểu hiện của hai thụ
thểβ1 và α5β1.
Với sự chuẩn bị hoàn tất các mô hình thử nghiệm vận chuyển in vitro, khảo sát sự
vận chuyển hạt nano có định hướng được thực hiện. Công thức C có và không có gắn
RGD được ủ trên mô hình đồng nuôi cấy và nuôi cấy đơn ở 37oC, trong 90 phút [21]. Với sự hiện diện của PCL-PEG-GRGDS trong công thức giúp tăng sự vận chuyển hạt
nano đi qua hàng rào tế bào 3.5 lần so với công thức không mang phân tửđịnh hướng [21]. Trái lại, trong mô hình nuôi cấy đơn không có sự khác biệt ý nghĩa giữa công thức mang và không mang RGD. Để khẳng định việc gắn RGD cho phép định hướng hạt nano với mục tiêu là tế bào M, kháng thể kháng thụ thể β1 integrin được bổ sung vào môi trường. Khảnăng vận chuyển hạt nano-RGD trong mô hình đồng nuôi cấy bị
75
ức chế và chỉđạt giá trịnhư công thức không định hướng [21]. Kết quả thể hiện trên
Đồ thị 3.3.
Hình 3. 3: Sự biểu hiện thụ thểintegrin β1 và α5β1 bởi mô hình giống tế bào M. (A), (B) là mô
hình nuôi cấy đơnvà đồng nuôi cấy xử lý với kháng thể kháng thụ thểintegrin β1. (C), (D) là mô
hình nuôi cấy đơn và đồng nuôi cấy xử lý với kháng thể kháng thụ thểintegrin α5β1. [21]
Đồ thị 3. 3: Kết quả khảo sát tác động của việc gắn RGD lên hạt nano đến hiệu quả vận chuyển
76
thí nghiệm là 2.7*1010 hạt/ml. Papp là hệ sốđánh giá khảnăng thấm qua tếbào được xác định
bởi phương pháp “fly cytometry”. [21]
Các kết quả thử nghiệm vận chuyển hạt nano in vitro đã đạt được mục đích cải thiện sự vận chuyển của hạt nano bằng cách định hướng với phân tử RGD trong công thức C. Đồng thời cho thấy RGD là một ligand có thểtương tác tốt với thụ thể integrin của tế bào M, là hướng phát triển hiệu quả tăng cường vận chuyển hạt nano bởi định
hướng tế bào M [21].
3.2.4. Kết quả chủng ngừa với hạt nano mang kháng nguyên ovalbumin trên chuột trên chuột
Thử nghiệm chủng ngừa theo đường miệng trên chuột được thực hiện với 5 µg kháng nguyên với nhiều phương thức chuẩn bị, protein ovalbumin và phương pháp tiêm kháng nguyên qua cơ được sử dụng làm đối chứng. Các thông số được đo gồm mức đáp ứng IgG, sự sản xuất IFN-γ (Đồ thị 3.4), và sự sản xuất IL-4. Với công thức
A, B, C, lượng kháng thể IgG 10 tuần sau chủng ngừa được xác định lần lượt trên 3, 0, 2 con chuột trong tổng số 8 con thí nghiệm. Và kết quả cũng không có sự tăng khác
biệt nào đối với nhóm sử dụng hạt nano có định hướng, số liệu ghi nhận có 3, 5, 4 trong 8 chuột thử nghiệm có mức đáp ứng kháng thể sau 10 tuần khi chủng ngừa với hạt nano gắn RGD lần lượt theo công thức A, B, C. Lượng kháng thề IgG trong máu của chuột cho ăn với ovalbumin không được ghi nhận ở cả 8 con chuột trong tuần thứ 10, điều này nhấn mạnh vai trò quan trọng của việc sử dụng chất mang bảo vệ kháng nguyên [21]. Trong trường hợp tiêm kháng nguyên vào cơ, kháng thể IgG duy trì ở
mức cao nhất trong các khảo sát trên cả8 đối tượng thí nghiệm. Tuy nhiên, một điều
đáng lưu ý ởđây là với một lượng rất nhỏ kháng nguyên (5 µg), các hạt nano đã có thể gây được đáp ứng miễn dịch ở chuột, so với lượng 100 µg sử dụng khi tiêm cơ [21].
Khảo sát đáp ứng miễn dịch tế bào cũng được thực hiện, sự sản xuất IFN-γ đạt mức cao ở các đối tượng chủng ngừa theo đường miệng. Với công tác xử lý thống kê, sự
khác biệt về mức IFN-γ giữa các nhóm là có ý nghĩa [21]. Đối với sự sản xuất IL-4, mức ghi nhận rất thấp, <30 pg/ml (dữ liệu không trình bày).
3.2.5. Kết luận
Các công thức với thành phần PLGA, PLGA-PEG, PCL-PEG khác nhau được khảo sát một sốđặc điểm và đều cho thấy tính bền vững và ổn định cao trong dịch tiêu hóa ở dạ dày và ruột, thích hợp ứng dụng chuyển giao vaccine theo đường miệng.
Trong đó, công thức C cho thấy hiệu quả vận chuyển tốt nhất, tính đặc hiệu đối với tế bào M được khẳng định qua thí nghiệm sử dụng chất ức chế thụ thểβ1 integrin. Công thức B không cho thấy kết quả tương tự [21]. Điều này được giải thích bởi khảnăng tương tác của ligand trên bề mặt hạt nano hiệu quảhơn với công thức C, do thành phần với PEG thấp hơn công thức B (30% so với 55%). 30% PEG trong công thức C là giá
77
trị đủ để thay đổi độ tích điện của bề mặt hạt nano (điện thế zeta = -9 mV so với -40 mV khi không có PEG) [21].
Đồ thị 3. 4: Kết quảđánh giá mức đáp ứng kháng thể IgG trong máu (sau 10 tuần trên 8 chuột
thí nghiệm) và lượng IFN-γ được sản xuất (sau 13 tuần trên 4 chuột thí nghiệm) khi chủng ngừa
với hạt nano mang kháng nguyên (ovalbumin) theo các công thức qua đường miệng. Ovalbumin
tự do chủng ngừa theo đường miệng và tiêm cugn4 được khảo sát để so sánh. [21]
Kết quả thử nghiệm hạt nano mang kháng nguyên ovalbumin theo đường miệng ở
chuột có thể gợi được đáp ứng miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào, cho thấy kháng