Concentration)
Việc xác định giá trị MIC nhằm giúp cho việc sử dụng kháng sinh đúng liều, qua đó hạn chế được hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn.
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trong môi trường lỏng, theo tiêu chuẩn của CLSI (2006) với các loại kháng sinh có tính kháng cao và đại diện cho các nhóm kháng sinh. Từ kết quả làm kháng sinh đồ lựa chọn loại kháng sinh có độ nhạy cao để đưa vào thử nghiệm MIC bao gồm: tetracycline, streptomycine, nalidixic acid, gentamicine, doxycycline,
Vi khuẩn Vibrio
alginolyticus
Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý
Điều chỉnh độ đục vi khuẩn ( Nồng độ tương ứng 108 cfu/ml)
Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường TSA
Đặt khoanh giấy kháng sinh lên bờ mặt đĩa thạch
Đo vòng vô khuẩn
Xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn V.alginolyticus
ciprofloxacine thuộc các nhóm thuộc các nhóm tetracycline, quinolone, aminoglycosides cụ thể thực hiện theo hai bước:
Bước 1: Thử kháng sinh ở nồng độ cao nhất
Bước này làm cơ sở cho bước 2 (xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh lên vi khuẩn V.alginolyticus).
Phương pháp thực hiện:
- Cho 1ml thuốc kháng sinh với nồng độ tương ứng là 1000 ppm, 400 ppm và 100 ppm vào 3 ống nghiệm.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn V.alginolyticus cần kiểm tra trong môi trường pepton
(1%) ở nồng độ 1 x 105 cfu/ml.
- Cho 1ml huyền dịch vi khuẩn tạo được vào 3 ống nghiệm trên.
- Ủ qua đêm tất cả các ống nghiệm ở nhiệt độ 30oC
- Quan sát độ đục của dịch huyền phù ở các ống nghiệm để nhận biết dấu hiệu phát triển của vi khuẩn. Từ đó xác định được nồng độ thuốc ban đầu cho thí nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Bước 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (được mô tả theo Hình 2.4)
- Cho 1,8ml môi trường pepton (1%) vô trùng vào ống nghiệm đầu tiên và 1ml môi trường pepton vào 8 ống nghiệm còn lại
- Cho 0,2 ml thuốc kháng sinh với nồng độ 2000 ppm vào ống nghiệm đầu tiên (số 1).
- Chuyển 1ml có thuốc từ ống nghiệm số 1 sang ống nghiệm số 2, trộn đều.
- Theo cách này tiếp tục cho đến ống nghiệm số 8, riêng ống nghiệm số 9 không cho thuốc kháng sinh vì là ống nghiệm đối chứng. Thay đổi pipét giữa các lần chuyển sang ống nghiệm để ngăn chặn thuốc kháng sinh dính trên bề mặt ngoài của pipét làm sai lệch nồng độ thuốc ở các ống nghiệm.
- Hút 1 ml môi trường lỏng có thuốc từ ống nghiệm số 8 bỏ ra ngoài.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn ở nồng độ 1 x 105 cfu/ml trong môi trường pepton (1%).
- Thêm 1 ml huyền dịch vi khuẩn tạo được vào mỗi ống nghiệm (9 ống). Lúc này ống nghiệm đầu tiên có nồng độ kháng sinh 100 ppm (vì thêm 1ml vi khuẩn nên nồng độ giảm xuống ½). Các ống nghiệm tiếp theo nồng độ kháng sinh sẽ bằng một nửa nồng độ của ống nghiệm trước nó.
ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 nồng độ thuốc 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78125 0
(ppm)
- Quan sát độ đục của dịch huyền phù ở các ống nghiệm để nhận biết dấu hiệu phát triển của vi khuẩn. Nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó vi khuẩn không phát triển được chính là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
0,2ml
Hình 2.4: Sơ đồ thực hiện pha loãng kháng sinh để nghiên cứu nồng độ ức chế tối thiểu MIC