Phú Yên cũng như các tỉnh Nam Trung Bộ Việt Nam mang đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa, chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương nên tương đối ôn hòa, khí hậu chia thành hai mùa: mùa khô (tháng 1-8) và mùa mưa (tháng 9-12). Nhiệt độ nước biển tầng mặt vào mùa khô khoảng 28-29oC, mùa mưa khoảng 24,2-25,5oC [25].
Phân tích một số đặc điểm thủy lý thủy văn cho thấy Phú Yên là tỉnh có môi trường tự nhiên thích hợp cho tôm hùm cư trú do vậy mà nghề nuôi tôm hùm rất phát triển, là nơi tập trung lồng nuôi và sản lượng cao nhất của cả nước. Năm 2012 cả nước có khoảng 50.000 lồng nuôi tôm hùm thì riêng tỉnh Phú Yên đã chiếm tới khoảng 35.000 lồng, chủ yếu ở Sông Cầu, vùng biển Vũng Rô (Đông Hòa) cũng đang tập trung gần 10.000 lồng nuôi tôm hùm.
Chương 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, phạm vi, thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus
2.1.2. Phạm vi: Vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân
nuôi lồng tại vùng biển Phú Yên
2.1.3. Thời gian: từ ngày 06/12/2013 đến 1/11/2014
2.1.4. Địa điểm
- Địa điểm thu mẫu và điều tra: Các hộ nuôi tôm hùm lồng tại hai xã Xuân Phương, Xuân Thịnh (thuộc thị xã Sông Cầu) và An Chấn (thuộc huyện Tuy An) của tỉnh Phú Yên (Hình 2.1).
- Địa điểm phân tích mẫu: Phòng nghiên cứu bệnh thủy sản và dự báo thuộc Trung tâm quốc gia quan trắc và cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
Hình 2.1: Sơ đồ vùng điều tra và thu mẫu
1 2 3 Ghi chú: 1. Xuân Thịnh (vùng nuôi thuộc đầm Cù Mông)
2. Xuân Phương (vùng nuôi thuộc Vịnh Xuân Đài)
3. An Chấn (vùng nuôi hở thuộc biển Đông)
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn
Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài luận văn Mức độ kháng
kháng sinh
Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông (Panulirus ornatus) bị bệnh đỏ thân nuôi lồng tại tỉnh
Phú Yên
Điều tra thực trạng nuôi và sử dụng kháng sinh ở tôm hùm
Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh
của Vibrioalginolyticus trên tôm hùm bông bị bênh đỏ thân
Thông tin thứ cấp
Thông tin sơ cấp Phân bố vùng nuôi Số hộ và số lồng nuôi Hiện trạng nuôi và kỹ thuật Hiện trạng bệnh và sử dụng kháng sinh Kháng sinh đồ theo phương pháp Kirbry- Bauer Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Đánh giá mức độ kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus phân lập ở
tôm hùm bông bị bệnh đỏ thân Đánh giá thực trạng nuôi và sử dụng
kháng sinh ở tôm hùm nuôi
2.2.2. Phương pháp điều tra thực trạng nuôi và sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh do vi khuẩn trên tôm hùm bông nuôi lồng tại vùng biển tỉnh Phú Yên do vi khuẩn trên tôm hùm bông nuôi lồng tại vùng biển tỉnh Phú Yên
2.2.2.1. Nguồn thông tin thứ cấp
Các thông tin được thu thập bằng phiếu điều tra thứ cấp (phụ lục 1) tại các cơ quan quản lý ngành như Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Phú Yên, Phòng kinh tế và Chi cục thú y huyện Tuy An và thị xã Sông Cầu, từ đây làm cơ sở thực tế để xác định: vùng điều tra, số lượng mẫu điều tra phỏng vấn, số mẫu tôm hùm bông thu phân tích (tất cả đều dựa theo nguyên tắc lựa chọn ngẫu nhiên và theo công thức Yamane, 1967).
Bảng 2.1: Phân bố số lượng phiếu điều tra hiện trạng nuôi và sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị bênh tôm hùm nuôi lồng năm 2014
Địa điểm (xã) Số hộ nuôi (hộ) Số hộ điều tra (hộ)
Xuân Phương 350 78
Xuân Thịnh 500 83
An Chấn 150 60
2.2.2.2 Nguồn thông tin sơ cấp
Phỏng vấn trực tiếp người dân bằng bộ phiếu câu hỏi được xây dựng sẵn (phụ lục 2) nhằm mục đích thu thập những thông tin:
- Các thông tin về chủ hộ nuôi: Họ tên, nơi ở, trình độ học vấn , chuyên môn
- Tình hình nuôi và bệnh trên tôm hùm nuôi lồng năm 2013-2014
- Các loại kháng sinh được sử dụng điều trị bệnh tôm hùm nuôi lồng ở địa phương
- Liều lượng sử dụng kháng sinh dùng trong điều trị bệnh
- Phương pháp sử dụng các loại kháng sinh trong phòng trị bệnh
- Hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh của người nuôi
Việc điều tra sẽ đánh giá được hiện trạng sử dụng kháng sinh và danh mục các loại kháng sinh trong điều trị bệnh đỏ thân ở tôm hùm từ thực tế.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu xác định hiện tượng kháng kháng sinh của Vibrio alginolyticus trên tôm hùm bông bệnh đỏ thân alginolyticus trên tôm hùm bông bệnh đỏ thân
2.2.3.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu tôm hùm
Thu mẫu tôm hùm có dấu hiệu đỏ thân nhằm mục đích mô tả các dấu hiệu bệnh lý, phân lập Vibrio alginolyticus, thu và lưu giữ chủng Vibrio alginolyticus để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu được thực hiện trên 3 dòng Vibrio alginolyticus phân lập từ tôm
hùm bị bệnh đỏ thân ở 3 xã: Xuân Phương (đặc trưng cho vùng nuôi thuộc đầm Cù Mông), Xuân Thịnh (đặc trưng cho vùng nuôi thuộc vịnh Xuân Đài) và An Chấn (vùng nuôi thuộc biển Đông) thể hiện Bảng 2.2
Bảng 2.2: Số lượng mẫu tôm hùm thu để phân lập Vibrio alginolyticus Địa điểm (xã)
Chiều dài (cm) (nhỏ nhất – lớn nhất)
Khối lượng (gam) (nhỏ nhất – lớn nhất)
Số lượng mẫu thu (con)
Xuân Phương 5-25 20-400 4
Xuân Thịnh 5-25 20-400 4
An Chấn 5-25 20-400 4
Mẫu tôm hùm: Thu chọn lọc những con còn sống, có dấu hiệu đặc thù của bệnh đỏ thân như: tôm yếu lờ đờ, bỏ ăn, nhìn phần bụng tôm thấy có màu đỏ hồng hoặc đỏ tím, khớp đôi chân bò rời ra, râu dễ gãy. Tất cả các mẫu tôm sau khi thu được phải vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp được sục khí.
Xử lý mẫu tôm hùm: Tôm được sát trùng bề mặt bằng cồn 70o trước khi lấy máu hay nội quan bên trong.
2.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn Vibrio alginolyticus
- Thu mẫu bệnh phẩm: Dùng panh, kéo đã sát trùng bằng cồn 70o để lấy gan tụy tôm bệnh.
- Đưa mẫu vào các ống nghiệm có chứa 2-3 ml nước muối sinh lý đã vô trùng.
- Rửa mẫu bằng nước muối sinh lý 2-3 lần, sau đó nghiền nát mẫu gan tụy tôm bệnh trong nước muối sinh lý.
- Mẫu sau khi xử lý tiến hành nuôi cấy trên môi trường TCBS (thiosulfat citrate bile saccharose). Thời gian nuôi cấy 24 giờ ở 30oC.
- Chọn những khuẩn lạc vàng có hình dạng khác nhau để làm thuần vi khuẩn.
- Xác định tên vi khuẩn gây bệnh: Các đặc điểm về hình thái, sinh hóa đã được kiểm tra bằng việc sử dụng bộ kít API 20E và soi trên kính hiển vi ở độ phóng đại từ thấp đến cao (100x đến 1000x). Vi khuẩn được định danh theo khóa phân lập Bergey [32] dựa trên phương pháp nghiên cứu của Frerich (1984) [36].
2.2.3.3. Phương pháp lập kháng sinh đồ:
Từ kết quả điều tra hiện trạng sử dụng kháng sinh, đưa ra lựa chọn các loại kháng sinh là thành phần chính của các sản phẩm thường được sử dụng trong thực tế để tiến hành lập kháng sinh đồ, 8 loại kháng sinh đã được chọn làm thí nghiệm bao gồm doxycycline, tetracycline, flumequine, ofloxacine, streptomycine, ciprofloxacine, acid nalidixic và gentamicine.
Phương pháp thực hiện: Dựa trên phương pháp Kirbry-Bauer (Hình 2.3) cụ thể được mô tả như sau [30]:
Bước 1: Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn Vibrio alginolyticus đã được làm thuần ở các lần phân lập khác nhau, cho vào ống nghiệm
chứa 10ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng.
Bước 2: Điều chỉnh mật độ vi khuẩn được xác định dựa vào phương pháp so màu trên máy quang phổ U-5100 (Hitachi-Nhật): dung dịch trộn đều trên máy voltex sau đó đem đo trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm, điều chỉnh độ đục ở mức OD= 0,1± 0,02, khi đó mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm tương ứng khoảng 1 x 108 cfu/ml.
Bước 3: Lấy 0,2 ml vi khuẩn từ ống nghiệm đã điều chỉnh mật độ trải đều trên đĩa thạch, sau đó gắn các đĩa kháng sinh (Hãng Biorad-Mỹ) vào đĩa thạch (đĩa kháng sinh là những mảnh giấy tròn có tẩm kháng sinh) và ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC.
Bước 4: Sau 24 giờ, đo đường kính vô trùng (mm) bằng thước kẹp có độ chính xác đến 1mm. Dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng của tài liệu CLSI- The Clinical and Laboratory Standards Institure (2006) để xác định loại kháng sinh nhạy, trung gian và kháng [64].
ủ 24 giờ
Hình 2.3: Sơ đồ thực hiện kháng sinh đồ vi khuẩn V.alginolyticus phân lập trên tôm hùm bông đỏ thân
2.2.3.4. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimal Inhibitory Concentration) Concentration)
Việc xác định giá trị MIC nhằm giúp cho việc sử dụng kháng sinh đúng liều, qua đó hạn chế được hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn.
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được xác định bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trong môi trường lỏng, theo tiêu chuẩn của CLSI (2006) với các loại kháng sinh có tính kháng cao và đại diện cho các nhóm kháng sinh. Từ kết quả làm kháng sinh đồ lựa chọn loại kháng sinh có độ nhạy cao để đưa vào thử nghiệm MIC bao gồm: tetracycline, streptomycine, nalidixic acid, gentamicine, doxycycline,
Vi khuẩn Vibrio
alginolyticus
Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý
Điều chỉnh độ đục vi khuẩn ( Nồng độ tương ứng 108 cfu/ml)
Cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường TSA
Đặt khoanh giấy kháng sinh lên bờ mặt đĩa thạch
Đo vòng vô khuẩn
Xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn V.alginolyticus
ciprofloxacine thuộc các nhóm thuộc các nhóm tetracycline, quinolone, aminoglycosides cụ thể thực hiện theo hai bước:
Bước 1: Thử kháng sinh ở nồng độ cao nhất
Bước này làm cơ sở cho bước 2 (xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh lên vi khuẩn V.alginolyticus).
Phương pháp thực hiện:
- Cho 1ml thuốc kháng sinh với nồng độ tương ứng là 1000 ppm, 400 ppm và 100 ppm vào 3 ống nghiệm.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn V.alginolyticus cần kiểm tra trong môi trường pepton
(1%) ở nồng độ 1 x 105 cfu/ml.
- Cho 1ml huyền dịch vi khuẩn tạo được vào 3 ống nghiệm trên.
- Ủ qua đêm tất cả các ống nghiệm ở nhiệt độ 30oC
- Quan sát độ đục của dịch huyền phù ở các ống nghiệm để nhận biết dấu hiệu phát triển của vi khuẩn. Từ đó xác định được nồng độ thuốc ban đầu cho thí nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Bước 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (được mô tả theo Hình 2.4)
- Cho 1,8ml môi trường pepton (1%) vô trùng vào ống nghiệm đầu tiên và 1ml môi trường pepton vào 8 ống nghiệm còn lại
- Cho 0,2 ml thuốc kháng sinh với nồng độ 2000 ppm vào ống nghiệm đầu tiên (số 1).
- Chuyển 1ml có thuốc từ ống nghiệm số 1 sang ống nghiệm số 2, trộn đều.
- Theo cách này tiếp tục cho đến ống nghiệm số 8, riêng ống nghiệm số 9 không cho thuốc kháng sinh vì là ống nghiệm đối chứng. Thay đổi pipét giữa các lần chuyển sang ống nghiệm để ngăn chặn thuốc kháng sinh dính trên bề mặt ngoài của pipét làm sai lệch nồng độ thuốc ở các ống nghiệm.
- Hút 1 ml môi trường lỏng có thuốc từ ống nghiệm số 8 bỏ ra ngoài.
- Tạo huyền dịch vi khuẩn ở nồng độ 1 x 105 cfu/ml trong môi trường pepton (1%).
- Thêm 1 ml huyền dịch vi khuẩn tạo được vào mỗi ống nghiệm (9 ống). Lúc này ống nghiệm đầu tiên có nồng độ kháng sinh 100 ppm (vì thêm 1ml vi khuẩn nên nồng độ giảm xuống ½). Các ống nghiệm tiếp theo nồng độ kháng sinh sẽ bằng một nửa nồng độ của ống nghiệm trước nó.
ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 nồng độ thuốc 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,78125 0
(ppm)
- Quan sát độ đục của dịch huyền phù ở các ống nghiệm để nhận biết dấu hiệu phát triển của vi khuẩn. Nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó vi khuẩn không phát triển được chính là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
0,2ml
Hình 2.4: Sơ đồ thực hiện pha loãng kháng sinh để nghiên cứu nồng độ ức chế tối thiểu MIC
2.3 Phương pháp xử lý số liệu
2.3.1 Phân tích hiện trạng nghề nuôi
Phân tích số liệu kinh tế-xã hội (độ tuổi, trình độ học vấn, kinh nghiệm nuôi tôm…) và quy trình kỹ thuật nuôi theo phương pháp thống kê mô tả
Tính toán số lượng phiếu điều tra dựa vào công thức Yamane n = N/ (1+N×e2)
Trong đó:
n là kích cỡ mẫu
N là tổng thể (dân số/quần thể)
e là xác suất phạm sai lầm loại II hay b (thường là 10%)
2.3.2 Phần mềm xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng các hàm round, countif, average trên phần mềm Excel của máy vi tính.
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả điều tra hiện trạng nghề nuôi và sử dụng kháng sinh ở tôm hùm nuôi lồng tại Phú Yên năm 2014 nuôi lồng tại Phú Yên năm 2014
3.1.1. Vùng nuôi và trình độ học vấn người nuôi tôm hùm ở Phú Yên
Theo kết quả khảo sát Phú Yên có 3 huyện/thị xã trọng điểm nuôi tôm hùm lồng là thị xã Sông Cầu, huyện Đông Hòa và huyện Tuy An. Trong đó huyện Đông Hòa và huyện Tuy An có số lượng lồng nuôi ít. Ở huyện Tuy An chủ yếu là ương tôm con, tại huyện Đông Hòa từ tháng 6/2012, UBND tỉnh Phú Yên có thông báo vịnh Vũng Rô đã được quy hoạch xây dựng cảng biển các hộ dân nuôi thủy sản trong vịnh phải dừng việc đầu tư mới và tự tháo dỡ di dời lồng, bè, trả lại mặt nước trước 31/12/2014. Do vậy, hiện nay nghề nuôi tôm hùm lồng ở Phú Yên tập trung chủ yếu ở thị xã Sông Cầu.
Trình độ văn hóa của người dân có ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận thông tin ứng dụng khoa học – kỹ thuật vào nuôi tôm hùm lồng cũng như việc phòng trị bệnh trên tôm hùm. Kết quả điều tra cho thấy trình độ học vấn của người dân nuôi tôm hùm tại Phú Yên tương đối thấp (Bảng 3.1)
Bảng 3.1: Trình độ học vấn của chủ hộ nuôi tôm hùm lồng đầu năm 2014 (n=221)
Trình độ văn hóa Tần số (hộ) Tần suất (%)
Không đi học 5 2,3
Cấp 1 107 48,4
Cấp 2 92 41,6
Cấp3 17 7,7
n: Số hộ điều tra
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, người dân chủ yếu là học hết cấp 1 (48,4%), và có 41,6% người dân học hết cấp II, lượng người dân học tới cấp III ít (7,7%) thậm chí có 2,3% người dân không biết chữ. Trình độ học vấn thấp của người dân nuôi tôm gây ra sự khó khăn trong quá trình truyền tải thông tin và tiếp cận khoa học công nghệ, hơn thế nữa những vùng nuôi là những vùng có điều kiện khó khăn về kinh tế phụ thuộc hoàn toàn vào nghề biển, với trình độ học vấn thấp như vậy việc lựa chọn ngành nghề khác để tạo thêm thu nhập là điều rất khó.
3.1.2. Hiện trạng nuôi và bệnh ở tôm hùm nuôi lồng ở Phú Yên đầu năm 2014
Tình hình nuôi tôm hùm lồng tại thị xã Sông Cầu từ năm 2010 đến năm 2013 được thể hiện Hình 3.1 và Hình 3.2 18,200 16,125 17,100 14,600 0 5,000 10,000 15,000 20,000 2010 2011 2012 2013 lồng 620 784 616 810 0 200 400 600 800 1000 2010 2011 2012 2013 tấn
Hình 3.1: Số lượng lồng nuôi tôm hùm Hình 3.2: Sản lượng tôm hùm nuôi lồng
Kết quả từ Hình 3.1 và 3.2 cho thấy, trong bốn năm từ 2010 đến 2013 số lượng lồng và sản lượng có sự dao dộng nhẹ, thấp nhất năm 2013 với số lượng lồng nuôi 14,600 lồng và cao nhất năm 2010 đạt 18.208 lồng. Tuy nhiên sản lượng tôm hùm lại tỷ lệ nghịch với số lồng nuôi, cụ thể năm 2012 với số lượng lồng 17,100 lồng sản lượng đạt được là 616 tấn, đến năm 2013 số lượng lồng giảm xuống còn 14,600 lồng thì sản lượng lại tăng lên 810 tấn. Có thể thấy rằng việc giảm lồng nuôi đã góp phần