Phương pháp tách chiết AND tế bào nấm mốc
Tế bào nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường YM dịch ở 30 oC trong 2-3 ngày. Lấy 2 vòng que cấy tế bào cho vào eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2x
vào mỗi ống. Lắc đều và đun ở 100 oC trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.
Hút bỏ phân dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thuỷ tinh , 150 µl phenol/chloroform (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa DNA và giữ ở - 20oC.
Phương pháp tinh chế DNA
Do DNA của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào Eppendorf vô
36
trùng. Bổ sung 150 µl dung dịch Binding buffer có chứa silica. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 2 phút. Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt thuỷ tinh. Rửa 3 lần bằng washing buffer. Sau đó phơi khô rồi bổ sung 15 µl nước cất vô trùng dùng cho PCR. Ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút. DNA ở phần dịch nổi là DNA đã được tinh chế. DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, phần còn lại giữ ở - 20 o
C.
Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing
Phản ứng PCR fingerprinting được tiến hành với thành phần phản ứng:
Tuỳ vào các mục đích khác nhau thể tích thành phần phản ứng có thể thay đổi khi đó thể tích của các thành phần được điều chỉnh sao cho tỉ lệ giữa chúng không thay đổi. Sau khi trộn các thành phần phản ứng như trên, phản ứng được tiến hành trên máy PE – geneamp PCR system 9700 với chu trình nhiệt thích hợp.
Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi MST2 trên máy Gene Amp, System 9700 (PE), chương trình MST2. Chu trình gia nhiệt như sau:
– Biến tính 94oC trong vòng 2 phút.
Đệm phản ứng ( 10x) 10µl
MgCl2 ( 25 mM ) 4µl
dNTPs ( 20 mM mỗi loại ) 2µl
Mồi MST2 ( GAC)5 ( 20 µM ) 4µl
Taq DNA polymerase ( 5u/µl) 0.5µl
DNA khuôn 1.5µl
Nước dùng cho PCR 78µl
37
– Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở
94oC trong vòng 40 giây, gắn mồi ở 52 oC trong vòng 1 phút 30 giây và kéo dài ở 72 o
C trong 2 phút .
Phương pháp điện di
Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1.5% với dung dịch đệm là 0.5xTAE. Load 3-5 µl mẫu cho mỗi giếng. Điện di với hiệu điện thế 50V.
Nhuộm gel và đọc kết quả
Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0.5 µg/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước cất để loại bỏ Ethidium Bromit bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát bằng máy soi gel Benchtop UV – Transilluminator VWR. Ảnh được chụp bằng máy Olympus 4040Z.
2.4.10.Phương pháp phân tích D – gluconic acid
Cơ chất: giấy lọc được đục bằng thiết bị đục giấy, mỗi mảnh khoảng 2.22 mg. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu thí nghiệm:
Cho vào eppendorf 10 -11 mg giấy lọc (khoảng 5 mảnh) và 0.2 ml đệm Na –
acetate 0.05M pH 4.8 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, ủ ở 500
C trong 5 phút.
Bổ sung vào eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50oC trong 2h – 3h.
38
+ Enzyme được làm biến tính ở 1000C trong 10 phút sau đó bổ sung vào eppendorf đã có sẵn cơ chất và đệm Na – acetate
+ Thay cơ chất giấy lọc bằng nước cất hai lần, sau đó bổ sung enzyme (đã được pha loãng tới nồng độ thích hợp).
Mẫu đối chứng dương: Sodium D-gluconate Tiến hành: Thành phần Blank (ml) Sample (ml) Nước cất 2.1 2 Sample - 0.1 Buffer (MgCl2 0.1M pH 7.6) 0.2 0.2 NADP+/ATP 0.02 0.02 6-Phosphogluconate dehydrogenase 0.02 0.02
Mix đều đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 340 nm (A1)
Gluconate kinase 0.02 0.02
Mix đều, đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 340 nm (A2)
Nồng độ D – gluconic acid được tính theo công thức:
c: nồng độ D – gluconic acid trong mẫu V: tổng thể tích phản ứng
39
e: hệ số triệt tiêu NADPH ở 340 nm = 6300 [l x mol-1 x cm-1] d: light path [cm]
v: thể tích mẫu thí nghiệm [ml]
40
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN